鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

马真，蔡绍曦，佟万成，耿穗娜，卢健聪，赵海金（南方医科大学南方医院呼吸内科，广东广州510515）

摘要：目的表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白CarO%(-binding%protein)融合蛋白并制备抗CarO多克隆抗体，为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础。方法构建pET23d-CarO重组表达质粒，转入大肠埃希菌BL21(DE3)，以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达，经镍离子金属螯合树脂纯化后，用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白，经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清。结论成功构建

pET23d-CarO原核表达质粒，表达并纯化出目标蛋白,%制备出高特异性的多克隆抗体。

关键词：鲍曼不动杆菌；外膜蛋白；融合蛋白；多克隆抗体中图分类号：R392

文献标识码：A

文章编号：1673-4254(2009)06-1265-03

鲍曼不动杆菌属不动杆菌属（Acinetobacter），是目前引起临床关注的常见致病菌

。有关鲍曼不动

杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及调控机制尚不明晰，围绕着外排泵［3］、青霉素结合蛋白［4］、碳青霉烯类酶［5］、外膜蛋白［6］缺失几个方面展开研究，研究发现细菌外膜相对分子质量25%000~29%000的外膜蛋白

［1-2］

CarO参与对碳青霉烯类酶抗生素的耐药机制

，有

关该蛋白的结构和功能亦尚不清楚。为研究该外膜蛋白是否参与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制以及进一步的调控机制，本研究构建了

［6］

G，carraaaaaAAGCTTtatgctcacctgatgctgac。

PCR扩增条件为：(1)预变性94%℃5%min；(2)94%℃30%s，58%℃30%s，68%℃60%s，共5个循环；(3)94%℃30%s，63%℃30%s，68%℃60%s，共28个循环；(4)%68%℃延伸10%min。利用PCR产物纯化试剂盒，根据设计引物上的酶切位点BamHI、HindⅢ分别对目的片断和pET-23d载体各进行双酶切反应。酶切产物分别用胶

回收试剂盒纯化回收后进行体外连接，连接产物转化入BL21大肠埃希菌，挑取菌落PCR阳性的单菌落送测序，与GenBank上carO序列(Gene%ID:%317259)%进行比对，确认序列准确无误后扩增质粒。

pET23d-CarO重组表达质粒，用表达出的His-CarO融合蛋白免疫家兔，最终获得特异性的抗CarO多克

隆抗体。

1%%材料与方法1.1%%材料

1.1.1%%实验动物由广东省动物实验中心提供。

1.1.2%%菌株大肠杆菌菌株，pET-23d载体及鲍曼不

动杆菌菌株为实验室保存。

1.1.3%%试剂PCR产物纯化试剂盒购自U-gene公司，BamHI、HindⅢ酶购自大连宝生物公司，Ni-NTA%亲和层析柱购自QIAGEN，弗氏完全、不完全佐剂购自威

佳公司，其余化学试剂均为国产分析纯和生化试剂。引物合成及DNA%测序由英俊公司完成。

1.2.2%%CarO蛋白的原核表达及表达形式的确立取pET-23d重组表达菌株，同时以含有空载体的菌株作对照，分别挑取单菌落至2%mL液体LB培养基（100%μg/mL%Amp），37%℃培养过夜。接0.1%mL种子液于10%mL新鲜LB培养基中（100%μg/mL%Amp），37%℃、200%r/min培养至OD550=0.5~0.6，加入IPTG至终浓度为1%mmol/L。诱导3%h后吸取1%mL菌液，离心，沉淀悬浮于200%μL%ddH2O中，加入等体积的2×SDS样品缓冲液，100%℃煮沸5%min后，上样，SDS-PAGE电泳观

察融合蛋白的诱导表达水平。

1.1.4%%仪器PCR仪，低温连接仪，蛋白电转移仪，电泳仪为Bio-Rad产品。1.2%%方法

1.2.1%%pET-23d%原核表达载体的构建根据已报道的carO基因的DNA序列设计引物，引物序列carf%aaaaaGGATCCCGATGAAAGTATTACGTGTTTTA收稿日期：2009-03-28

基金项目：广东省科技计划项目（2008A060202013）；广州市科技局重点攻关项目(2006Z1-E0141)

作者简介：马真（1971-），女，在读博士研究生通讯作者：蔡绍曦，E-mail:%hxkcai@http://wendang.chazidian.com

1.2.3%%融合蛋白的纯化按照方法1.2.2方法诱导50%

mL的菌液，离心收集后悬浮到10%mL%裂解缓冲液中，超声波处理至澄清，13%000%g%离心10%min后弃去细胞不溶残片，再离心15%min，收集上清液，根据Ni-NTA%亲和层析柱的吸附能力，按10%mg融合蛋白的量使用1%ml填料的比例吸取填料。把填料加入到重组蛋白中，轻柔混匀，室温结合30~60%min%，将混合

液小心加入到下端封闭的层析柱中，除去柱下端封闭的盖子，收集流出液（穿透峰），保存用于SDS-PAGE电泳分析，以4×5%ml缓冲液C漂洗杂蛋白，保存漂洗组分用于SDS-PAGE电泳分析，以4×1%ml缓冲液D洗脱目的蛋白，然后以4×1%ml缓冲液E洗脱，收集组分，用SDS-PAGE分析纯化情况。

1.2.4%%多克隆抗体的制备取约含1%mg左右的用

Ni-NTA纯化的融合蛋白溶液或直接割取含目的蛋白的SDS-PAGE电泳胶块加一定量的弗氏完全佐剂

进行乳化，乳化好的匀浆即可用于多点注射家兔。以后的2~3次加强免疫注射蛋白量减半，且采用不完全佐剂乳化注射，各次的时间间隔是10%d左右，待最后一次加强免疫注射7~10%d后采血，待血凝固后收集抗血清，血清分装于小管-20%℃保存待用。

1.2.5%%多克隆抗体Western%blot方法检测将2%ml过夜培养的菌液离心，沉淀悬浮于200%μL%ddH2O中，取20%μl加入等体积的2×SDS样品缓冲液，100%℃煮沸5%min后，上样，进行SDS-PAGE电泳，采用Western%blot方法和NBT-BCIP显色方法进行鉴定。

2%%结果

2.1%%carO基因蛋白编码区的PCR扩增

细菌培养后，抽提DNA后，PCR扩增carO基因蛋白编码区(642%bp%)，结果表明扩增片段大小与预期值相符(图1)%。

bp4500300020001200800500642

250

图1%%carO基因PCR产物电泳图

M：Marker；1：carO基因PCR扩增产物

2.2%%pET-23d原核表达载体的酶切鉴定

PCR产物经纯化试剂盒纯化，BamHI，HindⅢ对目的片断和pET-23d双酶切并连接后的产物转化入

大肠杆菌，获得重组子，碱裂解法提取重组质粒，酶切鉴定图见图2，显示重组载体购建成功。阳性克隆株送公司测序结果与carO基因序列一致。

2.3%%重组蛋白的表达结果

将重组表达蛋白进行Western%blotting%鉴定，结果表明：空载体经过诱导和pET23d-carO未经过诱导的阴性对照无表达,而经过诱导的大肠杆菌显示明显条带(图3)。

2.4%%His%抗体检测pET23d-CARO融合蛋白的表达和

纯化

用鼠抗His一抗对pET23d-CARO融合蛋白进行鉴定，得到相对分子质量为24%000的蛋白。

%bp%%%%%%%%%%M%%%%%%%%%%1%%%%%%%%%2%%%%%%%%%%%3%%%%%%%%%4%%%%%%%4500300020001200800CarO

500250

图2%%重组质粒PCR产物双酶切鉴定图

M：Marker；1-4：重组质粒的酶切产物bpM1%%%%%%%%%%2%%%%%%%%%3%%%%%%%%%%4%%%%%%%%%%5

974006620043000

bp

31000

24000

20000Mr

图3%%CarO重组蛋白蛋白表达分析图

1：蛋白marker；2：pET23d空载体未经诱导表达结果；3：pET23d空载体经诱导表达结果；4：pET23d-CARO未经诱导表达结果；5：pET23d-CARO经诱导表达结果

2.5%%pET23d-CARO融合蛋白免疫家兔后血清和纯化抗体的western%blot检测

将pET23d-CARO融合蛋白免疫家兔前血清、pET23d-CARO融合蛋白免疫家兔后血清和纯化抗体进行Western%blot检测，免疫前血清所做结果无蛋白

表达，纯化抗体表达效果比免疫后未纯化血清所做效果明显提高。

2.6%%多克隆抗体效价的ELISA%法分析

结果表明多克隆抗体效价>1∶512000，免疫兔1多克隆抗体效价较免疫兔2效价高。3%%讨论

细菌改变外膜蛋白的结构或者调节外膜通道蛋白的表达来减少抗生素透入菌膜从而逃逸抗生素的杀菌作用［7］。对碳青霉烯类抗生素渗入菌体的特异性外膜蛋白通道在铜绿假单孢菌中曾有报道，命名为

OprD［8］。

鲍曼不动杆菌同铜绿假单孢菌类似，外膜通道蛋白含量较少，通透性很低。王辉等

［9］

还采用SDS-%

PAGE分析体外亚胺培南CRAB突变菌株的外膜通道蛋白，发现OMP%20%000的缺失，OMP%29%000和OMP%21%000的表达降低。Limansky等［6］比较基因型

相同的分别对亚胺培南敏感和耐药的鲍曼不动杆菌

AB288和AB242的外膜蛋白，发现耐药菌的外膜蛋

白缺如相对分子质量约29%000的条带；将敏感菌经水杨酸钠处理后，则产生耐药，并且无相对分子质量为29%000的蛋白表达；用亚胺培南药物递增培养方法诱导出的耐药菌亦发现29%000的外膜蛋白缺失表达。

我们在制作多克隆抗体过程中发现，在其他实验中重组表达菌株经过IPTG诱导后，一般细菌浊度会变浓。本实验在用IPTG诱导表达蛋白之前，一般需要摇菌浓度为0.5~0.6%OD值之间，而我们在将细菌摇到光密度为0.5%OD值时，IPTG诱导后表达出蛋白，但是之后细菌的光密度会下降，似乎诱导产生的蛋白具有什么特性，会抑制细菌的生长；而将菌液浓度摇至0.8%OD值时，诱导产生出目的蛋白，细菌的继续生长没有受到抑制，或者说也有可能有抑制，但是至少可能达到生长平衡。

本研究成功制备了鲍曼不动杆菌的外膜蛋白

［5］［4］

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CarO的多克窿抗体，为日后研究鲍曼不动杆菌耐药

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