SPLUNC1多肽抗体的设计_制备与鉴定

ISSN　100727626C

N　1123870ΠQ

中国生物化学与分子生物学报

2006年6月22(6):513～518

?研究简报?

SPLUNC1多肽抗体的设计、制备与鉴定

周后德,　赵　瑾,　张　晋,　欧阳珏,　周　鸣,　彭淑平,　李小玲,　李桂源

(中南大学肿瘤研究所,长沙　410078)

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Design,PreparationandIdentificationofSPLUNC1PeptideAntibody

ZHOUHou2De,ZHAOJin,ZHANGJin,OUYANGJue,ZHOUMing,PENGShu2Ping,LIX2Ling,LIGui2Yuan

(CancerResearchInstitute,Central2SouthernUniversity,Changsha　410078,China)

摘要　通过设计SPLUNC1蛋白的一段多肽,SP能,为SPLUNC1的功能研究提供可靠的平台.用LUNC1蛋白的跨膜结构域、二级结构、疏水性、,,设计出两段15～20个氨基酸的多肽.(limpethemocyanin,KLH)偶联,同时初筛出宿主血清与SP,用与KLH相连的SPLUNC1多肽免疫家兔,2个月LUNC1多肽抗体,通过ELISA法检测其效价,免疫印迹与免疫组化检.通过该方法得到了高效价与高特异性的SPLUNC1多克隆特异性抗体,

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ELISA法测定其效价可达到1∶10,通过对包含有PLUNC家族不同成员的蛋白混合物进行Western印迹检测证明,该多肽抗体具有较高的特异性,不与同一家族中的其它蛋白发生交叉反应,而且该抗体可用于免疫组化,说明所制备的分泌性蛋白SPLUNC1抗体具有高特异、高效价等特点,将为SPLUNC1基因的功能研究提供有用的研究材料.关键词　SPLUNC1;多肽抗体;特异性中图分类号　R361　　SPLUNC1是一种在人的呼吸上皮特异性表达的[1]

基因,与小鼠的上腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate,lungandnasalepitheliumclone,PLUNC)基因高度同源,在猪、牛、大鼠等物种中都高度保守,分子量为26kD.在人类,至少发现有8个家族成员,都位于人类20号染色体大约300kb的狭窄区域———20q11.而在所有物种中至少包含14个家族成员,它们分别定位在人的20号、小鼠的2号、大鼠的3号染色体,

[2]

结构与LBP及BPI相似.又按照它们的大小分为两组,一组为长片段的PLUNC(longplunc,LPLUNC),包括484个氨基酸的LPLUNC1、458个氨基酸的LPLUNC2、463个氨基酸的LPLUNC3、大于469个氨基酸的LPLUNC4,它们都含有15个或16个

[3]

外显子;另一组为短片段的PLUNC(shortplunc,SPLUNC),包括256个氨基酸的SPLUNC1、249个氨基酸的SPLUNC2及253个氨基酸的SPLUNC3,它们

[4]

包含有9个外显子.分析表明,PLUNC家族成员在其5’端均具有19个氨基酸的信号肽序列,因而他

们可能是一种分泌性的蛋白.生物信息学研究发现,

SPLUNC13313%位于细胞外,33%位于线粒体,22%位于内质网,还有11%位于细胞内的小泡,通过蛋白质的三维结构预测并与已知蛋白结构数据库进行匹配,PLUNC蛋白与人类的其它2个蛋白家族具有相似性,即杀菌Π渗透增强蛋白(bactericidalΠpermeability2increasingprotein,BPI)和脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide2bindingprotein,LBP)家族,胆固醇酯转移蛋白(cholesterolestertransferprotein,CETP)及磷脂转移蛋白(phospholipidtransferprotein,

[5]

PLTP)家族.SPLUNC只含有一个BPI结构域,这个结构与对应的是BPI三维结构上位于N末端的桶状

收稿日期:2005211230,接收日期:2006201206国家自然科学基金项目(No.30300205)资助.

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联系人　Tel:073124805383,E2mail:Ligy@http://wendang.chazidian.com.

Received:November30,2005;Accepted:January06,2006

SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.30300205)

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CorrespondingauthorTel:073124805383,E2mail:Ligy@http://wendang.chazidian.com

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中国生物化学与分子生物学报22卷

结构,正是这种桶状结构,形成了一个疏水的口袋,允许脂溶性的物质如细菌脂多糖与之结合.而结合后的信号传导通路以及SPLUNC1的功能都有待于进一步研究.SPLUNC1抗体将为这一研究提供强有力的工具.因此,我们设计了SPLUNC1多肽,用于制备SPLUNC1多肽抗体.

乳化,在兔子背部进行多点皮内注射.之后每两周加强免疫一次,自第3次免疫加强注射后,在每次加强免疫后的第10d,从兔耳静脉中采取血样,进行SPLUNC1抗体效价的追踪检测,直至2个月后获得较满意的SPLUNC1抗体.115　SPLUNC1多肽抗体效价的测定

将SPLUNC1多肽标准品溶解于0105molΠL,pH916的碳酸氢钠包被缓冲液,浓度为1μgΠml,按100μlΠ孔将SPLUNC1多肽加入到96孔ELISA检测板中,4℃温育过夜,使SPLUNC1多肽抗原能稳定地吸附并包被在样品测定孔中.加入含有1%BSA的,37℃温育1小,,μl亲和纯化前后温育1h,PBS2T冲洗并吸,(HRP)标记的羊,孵育后洗涤,加入TBS显色底物.室温温育30min,酶标仪检测405nm波长下吸光值(A).116　SPLUNC1多肽抗体亲和纯化

首先将1mgSPLUNC1多肽与溴化氰(CNBr)活化后的Sepharose4B偶联,制备多肽亲和层析柱.将20ml兔抗SPLUNC1多肽血清与116ml多肽偶联的Sepharose4B共同加入离心管,4℃旋转混合6h.将凝胶加入层析柱,弃流出液,PBS冲洗凝胶.再加入1mlpH219、0

11molΠL甘氨酸缓冲液洗脱,共洗脱10次,洗脱液分别接入10支预先加入100μl2molΠLTris2HCl缓冲液(pH715)的收集管内,微量滴度板(BCA蛋白定量,Pierce公司)检测收集管内抗体浓度,ELISA检测抗体的效价.117　SPLUNC1多肽抗体的特异性鉴定

将在哺乳动物Cos7细胞中表达的重组SPLUNC1全长蛋白的细胞裂解液、在大肠杆菌中表达的SPLUNC12GST原核重组蛋白、包含有PLUNC家族不同成员的原代支气管上皮细胞裂解液以及从耳鼻喉科门诊取来的鼻咽分泌物(包含天然的SPLUNC1蛋白)与蛋白上样缓冲液混合,进行12%SDS2PAGE,上样时按同样的样品量将每种蛋白点两

1　材料与方法

111　材料

弗氏完全佐剂(FCA)购自GibcoBRL公司,载体蛋白交联试剂盒购自(PharmaciaBiotech公司),ECL化学发光试剂及BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司.免疫组化试剂盒及抗兔的二抗为福州迈新生物工程公司产品.新西兰大白兔为中南大学实验动物学部饲养.因的HNE1细胞系.112　SPLUNC1使用DSGene1,采用软件中提供的多种程序分析SPLUNC1蛋白的跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性、抗原性,同时在线分析SPLUNC1的糖基化等修饰位点.选取亲水性与抗原性较好的部位,设计一段15～20个氨基酸的多肽.将设计好的多肽再返回到蛋白数据库中进行匹配,检测该序列的特异性.将设计好的多肽交由美国Ptlab公司合成并纯化,用高效液相色谱测定其纯度大于98%.113　SPLUNC1多肽与KLH的偶联

称取SPLUNC1多肽500μg,溶解于011molΠL,pH714的PBS缓冲液中,再加入已溶解的KLH蛋

白,在混匀器上充分混合,然后慢慢滴加013%戊二

)下反应2h,最后加入1molΠ醛,室温(25℃L,pH

710的甘氨酸溶液,在室温下进行终止反应,并将此样品分装保存于-80℃中,直至应用.114　SPLUNC1多肽抗体的制备

免疫动物之前,预采取20只新西兰大白兔的血清,将含有SPLUNC1全长蛋白的细胞裂解液(原代

[7]

支气管上皮细胞裂解液)在SDS2PAGE上电泳,转至PVDF膜,用Bio2Rad公司的特殊孵育装置,将膜固定,分别以20只新西兰大白兔的预取血清为一抗,将血清加到各条泳道上孵育,按常规的Western印迹程序进行发光显影.以血清与裂解液完全无免疫反应信号的兔子作为免疫用兔.将与KLH连接的多肽100μg,加入等体积的完全福氏佐剂进行充分

个电泳孔,电泳完后转至PVDF膜,丽春红染色检查

转膜的好坏及有无气泡.将膜剪成含同样样本的两

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张,5%脱脂奶粉的PBS封闭后,按1∶10的稀释度加入SPLUNC1多肽抗体,同时对其中一张膜加入终浓度为10μgΠml的SPLUNC1多肽,37℃温育115h,后续步骤按Western印迹常规方法温育二抗,ECL化学发光、显影.118　免疫组化观察SPLUNC1在胚胎晚期鼻咽组织

第6期周后德等:SPLUNC1多肽抗体的设计、制备与鉴定515　

中的表达

鼻咽组织取自胚胎晚期经水囊引产的胎儿,取材后4%的多聚甲醛固定,常规石蜡包埋切片.按福州迈新公司提供的免疫组化试剂盒说明书进行操作,利用AEC显色试剂盒显色,水性封片剂封片.

个Ile,使得抗原性大大下降;第1段多肽的抗原性与亲水性虽然都不是最好,但综合起来却是能用于抗体制备的最优化片段.2段多肽经过与蛋白数据库匹配,与其它蛋白多肽没有同源性.我们使用这2段用于多肽抗体制备并在其羧基端加1个半胱氨酸以利于与KLH偶联.212　多肽抗体的制备与效价

我们将多肽序列送交公司合成后,成功地与KLH偶联并免疫新西兰家兔.在所初筛的20只家兔中,有4只家兔的血清与含SPLUNC1全长的裂解液有交叉免疫反应,SPLUNC1抗原免疫(Fig12).经过3,采血分离血清检测

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1∶10,而第2段,因而停止后者的加强免.,对第1段多肽的抗体利用肽亲

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,纯化后抗体的效价为1∶10.

2　结果

211　适合于SPLUNC1抗体制备的多肽

通过DSGene111基因分析软件对SPLUNC1蛋白的综合分析,发现SPLUNC1蛋白的亲水性较差,

可供选择的多肽设计位点不多,综合考虑多肽的亲水性、抗原性、所带的电荷、多肽位置、同源性、修饰位点以及其它多肽抗体的设计标准,我们设计出2段多肽用于抗体制备(Fig11,见第517页彩版).第2段多肽(

Fig11中蓝色标记部分)SPLUNC1蛋白序列中最好的一段Fig.2　Thescreenoftherabbitwhoseserumdidn’thavetheimmunoreactionwithSPLUNC1

SerumfromtwentyrabbitswereusedastheprimaryantibodiesforWesternblotanalysiswithSPLUNC1protein1Rabbit4and5,whoseserumdidn’thavetheimmunoreactionwithSPLUNC1,werechoosedforpeptideantibodyproduction

213　多肽抗体的特异性

为检测该多肽抗体与抗原结合的特性及特异性,我们选择了在哺乳动物Cos7细胞中表达的重组SPLUNC1全长蛋白的细胞裂解液、在大肠杆菌中表达的SPLUNC12GST原核重组蛋白、包含有PLUNC家族不同成员的原代支气管上皮细胞裂解液以及从耳鼻喉科门诊取来的鼻咽分泌物(包

含天然的SPLUNC1蛋白)与多肽抗体进行免疫印迹,发现该抗体能与变性的天然SPLUNC1蛋白、带有靶标记的重组蛋白结合(Fig.3).而且通过与含有PLUNC家族不同成员(分子量不同)的原代支气管上皮细胞裂解液间的免疫印迹实验仅发现一条明显的条带,说明该多肽抗体不与其它PLUNC家族成员发生交叉反应,具有较高的特异性.经用多肽将一抗阻滞后,印迹膜上的免疫反应条带强度明显减弱或消失(Fig.3),进一步说明了该多肽抗体具有较高的特异性.214　免疫组化验证SPLUNC1在鼻咽上皮的表达

我们制备的多肽抗体完全能用于免疫组化研

究.SPLUNC1可在人胚鼻咽的柱状上皮(Fig.4A)及上皮下腺体(Fig.4B)中表达,而在周围间隙组织中无表达.而利用免疫前的预采血血清为一抗在相同的组织标本上同时进行免疫组化时,没有检测到阳性的表达.

3　讨论

随着人类蛋白组计划及后基因组计划的进展,越来越多的新基因所编码的蛋白急待阐明.抗体是研究蛋白质功能的一个必不可少的工具.在一个新的基因被成功克隆后,依据推导出的氨基酸序列人工合成多肽并与载体偶联,制备抗多肽的抗体,用于该基因的功能研究是一个行之有效的手段.

在天然的蛋白质分子中其肽链按一定的规律进行折叠,其中某些肽段暴露于分子表面,而另一些肽段深藏于分子内部.因此,并非所有的肽段都能形成

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516中国生物化学与分子生物学报22卷

Fig.3　ThespecificityanalysisofSPLUNC1peptideantibody

TheantibodyhaspositivereactivitywithrecombinantSPLUNC12GSTor2FlagE1coliortheSPLUNC2FlagstabletransfectedCos7cells1Weonlydetectedaclearbandofthecellepitheliumcell,whichexpressesvariousPLUNCmembers1Whentheantibodieswerepre2absthe,theintensityoftheimmunoreactivebandwasreduced,theantibodyalsohaspositivereactivitywiththethenasopharyngealsecretions(NPS)

B细胞表位,刺激抗体的产生并与产生的相应抗体结合.一个天然B细胞表位的形成不仅与肽段的氨基酸序列有关,更与肽链的折叠形成的构象表位有关.通常一个蛋白质分子中亲水性的肽段部分暴露于分子表面,而疏水性的肽段部分则存在于分子内部.在制备抗人工合成多肽抗体时较为常见的是选择亲水性较强的部分,而且由于N端或C端容易暴露在蛋白的表面,尽量选N端或C端的多肽.每5个氨基酸中至少包含有天冬氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸及精氨酸等带电荷的残基.尽量包含MHCⅡ类分子基序,如天冬氨酸、酪氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸等在MHCⅡ类分子中出现频率很高的氨基酸,但当用液相合成方法时,避免有天冬氨酸2脯氨酸序列.由于蛋白的胞浆结构域比跨膜结构域更具有免疫原性,多肽的中央尽量不要包含有半胱氨酸,但它可加在两端以利于与KLH偶联.另外,要尽量避开磷酸化与糖基化的位点.异亮氨酸(Ile)等由于免疫原性弱,选择多肽序列时也要避免较多的Ile出现.根据以上这些原则,我们设计了SPLUNC1的两段多肽,而第二段多肽就可能由于包含有两个Ile,

造成免疫原性大大下降,因而免疫后不能产生高效价的抗体.多肽设计的长度一般为12～25个氨基酸,多肽越长,纯度越难提高.多肽设计后,要进行同源性分析,这样可以尽量减少非特异性反应的出现.

为加强免疫原性,合成后的多肽常需要与载体蛋白偶联.常用的载体蛋白有KLH、BSA、OVA、MAP和THY,如果制备的是无脊椎动物的抗体,应选用OVA、KLH作为载体蛋白.免疫前对动物的初筛非常重要,这也是大多数抗体制备者所忽略的.其实动物血清中很可能与目的蛋白或待测样品中的某些蛋白存在非特异性的交叉反应,经过初筛后可以减少非特异性反应的产生.

除抗体的效价外,抗体与不同条件下抗原的结合能力及其特异性是检测抗体好坏的另一标准.有些肽段形成的抗原决定簇在变性条件下会受到破坏,抗这些肽段的抗体将不能用于Western印迹,因此在制备抗人工合成多肽的抗体后有必要对其进行鉴定.我们的研究发现,制备的SPLUNC1多肽抗体不仅能与变性后的天然蛋白结合,而且能与重组的哺乳动物细胞表达蛋白或原核细胞表达蛋白结合,说明该多肽抗体能与不同条件下的SPLUNC1抗原结合,可用Western印迹对这些抗原进行检测.而且当我们用SPLUNC1多肽阻滞后,结合条带明显减弱或消失,说明我们的抗体是直接针对SPLUNC1多肽的.由于SPLUNC1属于PLUNC家族成员,后者包含有至少9个分子量不同的成员,我们利用该抗体与已知包含有多个PLUNC成员的裂解液进行Western印迹时也仅检测到一条清晰的条带,更进一步的验证了我们生产的多肽抗体的特异性.

已知在鼻咽组织中有SPLUNC1的表达,为鉴定我们生产的SPLUNC1抗体能否应用于免疫组化研究,我们利用胚胎的鼻咽组织对该抗体进行测验,发

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第6期周后德等:SPLUNC1多肽抗体的设计、制备与鉴定

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Fig.1　Thedesignofthepoly2peptidesforantibodyproductionby3DS2Gene111softw

are

Fig.4　TheSPLUNC1expressedattheepitheliumandglandsinthenasopharynx(redstained,indicatedbyarrows)byimmunohistochemistrystainingusingSPLUNC1peptideantibody