宫颈癌治疗性多肽疫苗的分子设计及免疫学功能研究

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宫颈癌治疗性多肽疫苗的分子设计及免疫学功能研究

徐道华　夏永鹏　邱宗荫　吴玉章　贾正才　邹丽云　周　伟(重庆医科大学药学系,重庆400016)

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　　中国图书分类号　R39212　　文献标识码　A　　文章编号　10002484X(2006)0520449204

[摘　要]　目的:探讨基于人乳头瘤病毒抗原优势表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方

法:以芴甲氧羰基固相法合成多肽,用高效液相色谱分析多肽的纯度,,用标准51Cr释放试验检测特异性细胞毒性T淋巴细胞活性。结果:,各肽的分子量测定值与理论值相符,T结论:在治疗性表位多肽设计中,将辅助性T。

[关键词]　子宫颈癌;MoleculmiceffectoftherapeuticpeptidevaccineagainstcervicalXUDao2Hua,XIAYong2Peng,QIUZong2Yin,WUYu2Zhang,JIAZheng2Cai,ZOUli2Yun,ZHOUWei.Depart2mentofPharmacy,ChongqingUniversityofMedicalScience,Chongqing400016,China

[Abstract]　Objective:ToexploretherelationbetweenthesecomponentsandstructureofthetherapeuticpeptidebasedhumanpapillomavirusepitopeandtheirtriggeringcytotoxicTcell.Methods:Thesepeptidesweresynthesizedwithsolidphasestrategies,puri2fiedwithreversephaseHPLCandidentifiedwithmassspectrometry.TheactivityofspecificCTLwasmeasuredbyusingastandard4h

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Crreleaseassay.Results:Allpeptideswerehigherthan80%inpurityandshowntohavetheexpectedmolecularmass.Thethera2

peuticlipopeptidecouldinducestrongspecificCTLactivityinvitroandinvivo.Conclusion:ThecombinationofCTLandThelperepitopeandlipidmoleculecanremarkablyimprovetheimmunogenicityofCTLpeptide.

[Keywords]　Cervicalcancer;Epitope;Therapeuticvaccine

　　子宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,其在全球妇女癌症发病率中居第二位,在其治疗中虽然采用了手术、放疗、化疗等多学科的综合治疗,取得了一定的效果,但毒副作用大。近年来,随着越来越多的肿瘤抗原的鉴定,使基于肿瘤抗原的特异性疗法成为可能,由于此疗法对肿瘤治疗具有特异性,因此毒副作用小,已成为肿瘤生物治疗的重要研究方向。研究表明,生殖道的人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)的感染同宫颈癌的发生发展密

[1,2]

切相关。HPV早期基因E7的表达在细胞癌变进程和维持癌细胞恶性表型方面起着重要作用,是

[3]

维持肿瘤细胞处于转化状态所必需的。而且,正常组织中不存在这种蛋白。因此,本研究以HPVE7作为靶标,设计并合成宫颈癌治疗性疫苗,并对其免疫学效应进行了探讨。

①重庆市食品药品监督管理局,重庆400016②第三军医大学全军免疫学研究所,重庆400038

作者简介:徐道华(1971年-),男,博士,主管药师,主要从事肿瘤疫

苗与新药的开发研究,现工作单位:广东省湛江市霞山区文明东路2号广东医学院药理教研室,湛江524023。

1　材料与方法

111　多肽疫苗的分子设计　研究已证实T细胞识

别抗原不是完整的蛋白质分子,而是抗原递呈细胞主要组织相容性复合体分子递呈的多肽。因此,可根据T细胞识别的表位进行多肽疫苗的设计,并可采用化学法合成多肽疫苗,辅以适当的佐剂,即可在体激发细胞毒性T淋巴细胞(CytolyticTlympho2cyte,CTL)反应。但是由于单纯的CTL表位分子

小,一般免疫原性差,因此,限制了其在免疫治疗中的应用。如何在体启动CTL反应,则成为该疫苗研制的难题。根据最近的研究报道,辅助性T细胞(helpTlymphocyte,Th)在诱导CTL反应中起重要作用

[4,5]

。另外,研究报道将脂类分子构建于多肽分

[6]

子内部可促进多肽进入细胞内和抗原交叉提呈。

因此,本研究依据基于表位设计疫苗(Epitope2basevaccinedesign,EBVD)的技术路线,以HPVE7抗原86～93表位为基础,引入TH表位、脂尾,设计合成

了脂肽疫苗P1,同时合成了两个对照肽P2、P3(其

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序列见表1),以研究其结构与诱导免疫应答之间的关系。112　主要试剂　二甲氨基吡啶(DMAP)、12羟基苯并三唑(HOBT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、王氏树脂、哌啶及Na2CrO4均为美国PE公司产品;棕榈酸(PAM)、合成用氨基酸及不完全弗氏佐剂(IFA)

γ)检测试剂盒均为Sigma公司产品;干扰素γ(IFN2

为法国Diaclone公司产品。

113　多肽的合成、纯化及鉴定　采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相化学合成方案,起始选用01125mmol/L

51

制备脾细胞,调整细胞数为1×10ml,同时加入多肽使终质量浓度为1nmol/ml,次日加入IL2230U/ml,37℃、5%CO2孵育3天后收集上清进行IFN2γ检测,1周后收集细胞用作效应细胞。以JurkatA211/K细胞系为靶细胞,加入多肽P3使终质量浓

b

6-1

度为10nmol/ml,37℃、5%CO2孵育90分钟,用1640培养基充分洗涤细胞后,调整细胞数为1×10

-1

51

[7]

5

ml用作靶细胞。采用标准Cr释放试验检测特异

王氏树脂,基端延伸。1基酸连接到HOBT和200l/L哌啶溶液

性CTL细胞毒效应。

ISA法检测胞外11IF2

,1t检验对各组数据进行分析。

2　结果

211　多肽的合成、纯化及鉴定　所合成多肽经纯化

去除Fmoc仪上纯化并分析各肽的纯度,用电喷雾质谱鉴定分子质量。114　体外诱导PBMC抗原特异性效应CTL应答　HLA2A2阳性健康人的外周血经常规聚蔗糖2泛影葡

胺分层液梯度离心法分离,获得外周血单个核细胞(PBMC),用含100ml/L胎牛血清的1640培养基调

6-1

整细胞数为1×10ml。分别用P1、P2及P3肽反复刺激PBMC,每7天加肽刺激1次,多肽终质量浓度为10nmol/ml,次日加入IL2230U/ml,刺激3次

γ检测,第5天收集后第3天,收集上清进行IFN2

PBMC,用作效应细胞。以T2细胞或Caski细胞作为靶细胞,加入P3多肽使终质量浓度为10nmol/ml,37℃、5%CO2孵育90分钟,用1640培养基充分洗涤细胞后,调整细胞数为1×10ml用作靶细

51

胞。采用标准Cr释放试验检测特异性CTL细胞毒效应。115　在体诱导抗原特异性效应CTL应答　选择

b

8～12周龄雌性HLA2A211/K转基因鼠,随机分为4组,每组5只,分别于尾根部注射以IFA充分乳化的P1、P2及P3多肽,剂量为每只50nmol,对照组则注射IFA充分乳化的磷酸缓冲盐溶液(PBS),2周后加强免疫1次,在末次免疫后15天取小鼠的脾脏

表1　多肽的结构

Tab11　Thestructuresofpeptides

PeptideP1P2P3

Lipidmolecule

PAM--Adaptersequence

KSS--ThepitopesequenceQYIKANSKFIGITEQYIKANSKFIGITE

-[7]

5

-1

后在高效液相色谱仪上分析各肽的纯度P1、P2及

P3纯度分别为8615%、8118%和9815%,经质谱分析各肽的分子量分别为3121、2580和815,与理论值相符。212　多肽体外诱导PBMC表位特异性效应CTL应答　以负载表位肽T2细胞为靶细胞,P1、P2及P3肽均诱导出较强的CTL活性(P<0101,与对照组比较),其中又以P1的效应最强(P<0105,与P2及P3组比较),而以未负载表位肽的T2细胞为靶细胞,P1、P2及P3肽所诱导的CTL对其特异性溶破率均小于10%。此外,P1、P2及P3经体外诱导产生的CTL,均能杀伤Caski细胞(P<0101,与对照组比较),见图1。

γ的分泌　胞外IFN2γ213　多肽诱导PBMCIFN2

γ分泌细胞的增殖情况,由的浓度可反映IFN2

ELISA测量值可见,P1、P2及P3肽均诱导PBMC分

γ(P<0101,与对照组比较),其中又以P1的泌IFN2

效应最强,见图2。214　多肽在体诱导的特异性CTL效应　以负载表

b

位肽的JurkatA211/K为靶细胞,结果表明P1诱导出了较强的CTL活性,在E/T=100∶1时,靶细胞特异性溶破率为6510%(P<0101,与对照组及P2组

Linkersequence

GGGGGG-

CTLepitopesequence

TLGIVCPITLGIVCPITLGIVCPI

Carboxylterminus

OHOHOH

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图1　P1、P2及P3分别在体外诱导人PBMC特异性CTL反应

Fig11　SpecificCTLresponseofPBMCfromhealthybloodithP1,Note:A1TargetwasT2pulsedwithpeptide;B1Target

γ浓度的检测图2　PBMC胞外IFN2

γofthesupernatantin

PBMCFig12　DetectionofIFN2

Note:31P<0.01vsPBS.

γ浓度的检测图4　小鼠脾细胞胞外IFN2

γofthesupernatantinspleencellsFig14　DetectionofIFN2

Note:31P<0101vsPBS.

比较);P2也诱导出了CTL活性,在E/T=100∶1

时,靶细胞特异性溶破率为3515%(P<0101,与对照组比较);而用P3诱导的CTL却对靶细胞基本无特异性杀伤作用(P>0105,与对照组比较)。但以

b

未负载表位肽的JurkatA211/K为靶细胞,P1、P2及P3肽所诱导的CTL对其特异性溶破率均小于10%,见图3。

γ的分泌　由215　多肽诱导小鼠脾细胞IFN2

ELISA测量值可见,P1及P2肽均能诱导PBMC分

γ(P<0101,与对照组比较),其中又以P1的泌IFN2

γ(P>效应更强;而P3并不能诱导PBMC分泌IFN2

0105,与对照组比较),见图4。

3　讨论

目前,宫颈癌治疗性疫苗有基于树突状细胞疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗、蛋白疫苗等,但这些疫苗都存在安全性及制备工艺复杂等缺点,多肽疫苗由于是针对肿瘤特异性抗原而设计的,特异性高,安全性好,而且,多肽疫苗可采用人工合成,其制备方便,纯度高,质量容易控制,因此,具有广阔的前景。但由于多肽疫苗的免疫原性较低,

很难在体诱导出

b

图3　P1、P2及P3分别在HLA2A211/K转基因鼠诱导特

异性CTL反应

b

Fig13　SpecificCTLresponseofHLA2A211/Ktransgenic

micestimulatedwithP1,P2andP3

Note:A1TargetwasJurkatA211/Kbpulsedwithpeptide;B1

Targetwas

JurkatA211/Kbpulsedwithoutpeptide.

452

[8,9]

。因此,寻找提高多肽免疫原的手段,

对于多肽疫苗的研制意义重大。本研究以不同多肽体外诱导的PBMC为效应细胞,以负载表位肽T2细CTL活性

后同时提呈到同一APC表面,使Th、CTL细胞时空

[5,11]

相近,从而增强CTL活性。

胞及Caski为靶细胞,结果显示含CTL、Th和脂类分

子组合的模拟多肽抗原P1诱导抗原特异性效应CTL产生的功能显著高于含CTL、Th表位组合的模拟抗原肽P2和单纯CTL表位肽P3,提示在治疗性表位多肽设计中,将CTL表位同Th表位及脂类分子构建的多肽可显著提高CTL表位肽的免疫原性。此外,研究还发现,P1、P2及P3多肽所诱导的CTL均不能杀伤未负载表位肽的T2细胞,诱导的CTL均具有表位特异性HLA2A2111,其MHCⅠ分子的、结构域可同HLA2A2限制性CTL表位结合,而a3结构域可同小鼠CD8分子结

b

合,HLA2A211/K转基因鼠为研究HLA2A2限制性

[10]

表位重要的动物模型。本研究结果显示,P1肽诱导出最强的抗原特异性CTL效应,P2肽也诱导出了较强的抗原特异性CTL效应,P3肽未能诱导出抗原特异性CTL效应,说明辅助性T细胞在诱导抗原特异性CTL效应中起重要作用,这同以前的相关报

[4,5]

道一致。总之,CTL、Th和脂类分子组合的模拟多肽抗原P1在体内外均诱导出了较强的抗原特异性CTL效应,且显著高于含CTL、Th表位组合的模拟抗原肽P2和单纯CTL表位肽P3所诱导出的抗原特异性CTL效应,说明在多肽疫苗的设计中,将Th表位及脂类分子构建于分子内部可提高CTL表位肽的免疫原性,有效诱导抗原特异性CTL细胞的产生。其可能的作用机制为脂类分子可有效协助外源性多肽

[6]

进入APC胞内,促进抗原交叉提呈;此外,将CTL、Th表位构建于分子内部可使二者被APC摄取

4　参考文献

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Inhibitionoftumorige2

ofinHPVE6E7antisense

[收稿2005201229　修回2005204204]

(编辑　许四平)

消息

《上海实验动物科学》征稿征订启事

　　《上海实验动物科学》是我国实验动物科学领域第一本专业期刊,创刊于1981年。20多年来刊出有关实验动物和动物实验的各类文稿近2000篇,内容主要包括:实验动物遗传育种、饲养管理、微生物控制、人类各种疾病动物模型制作及应用、动物实验方法和技术、人类与动物生理、解剖、病理、毒理等方面的比较研究。

本刊已被国内外多种数据库如:《ChemicalAbstracts》、中国生物医学文献数据库、中国学术期刊综合评价数据库、中文科技期刊数据库等收录,并已成为《中国期刊网》、“万方数据2数字化期刊群”等的入网期刊。

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