高脂大鼠脑缺血再灌注后脑组织MCP1的表达及塞来昔布的干预作用

上传者：边学工
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上传时间：2015-04-28
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高脂大鼠脑缺血再灌注后脑组织MCP1的表达及塞来昔布的干预作用

中西医结合心脑血管病杂志２０１１年３月第９卷第３期

３３５

高脂大鼠脑缺血再灌注后脑组织ＭＣＰ～１的

表达及塞来昔布的干预作用

高建英。壬荔。张小菊

摘要：目的探讨高脂血症大鼠脑缺血／再灌注后脑组织单核趋化蛋白一１（ＭＣＰ一１）的表达及塞来昔布的干预作用。方法Ｗｉｓｔａｒ大鼠７０只，随机分为４组，Ａ组为假手术组（行＝１０）、Ｂ组为正常对照组（”＝２０）、Ｃ组为高脂组（咒＝２０）、Ｄ组为塞来昔布高脂组（竹＝２０）。首先建立高脂血症大鼠，在此基础上采用线栓法制作大脑中动脉闭塞（ＭＣＡ（））模型。采用分光光度计法、ＴＴＣ染色法及免疫组化法分别检测各组大鼠血脂水平、脑梗死体积及ＭｃＰ一１的表达水平。结果组相比，大鼠脑梗死体积明显减小，ＭＣＰ—ｌ的表达明显减少（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论

与Ａ组相比，Ｂ组脑梗死体积明显增加，

ＭＣＰ一１的表达明显增加（Ｐ＜Ｏ．０５）；与Ｂ组相比，Ｃ组和Ｄ组脑梗死体积明显增加．ＭＣＰ一１的表达明显增加（Ｐ＜０．０５）；Ｄ组与Ｃ

高脂血症可加重脑缺血再灌注后脑损伤的发生和

发展；塞来昔布可通过降低炎性因子ＭＣＰ一１的舍量来减小脑缺血再灌注后脑组损伤。

关键词：脑缺血／再灌注损伤；高脂血症；单核趋化蛋白一１；塞采昔布

中图分类号：Ｒ７４３

Ｒ２８５．５

文献标识码：Ａ

文章编号：１６７２—１３４９（２０１１）０３～０３３５一０２

高血脂是脑梗死发病的一个高危险因素，血脂异常和脑卒中关系是目前临床的研究热点之一。本实验在高脂血症大鼠基础上建立Ｉ／Ｒ模型，探讨高脂血症在脑缺血再灌注脑损伤的发

生和发展中的作用。

冰箱５ｍｉｎ使之冷冻发硬，按２ｍｍ厚度冠状切片，将切片置于２％ＴＴＣ磷酸盐缓冲液中，３７℃温箱孵育染色１５ｍｉｎ～３０

ｍｉｎ，

苍白色为梗死灶，红色为正常组织。用数码相机拍照，输入计算机，用计算机病理图像分析仪器测量脑片两个面的梗死面积．根据梯形法则计算出脑梗死灶体积和脑的总体积，并计算梗死灶体积比。

１．２．３

脑缺血再灌注后脑组织局部过度炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一［“。单核趋化蛋白一１（ＭＣＰ～１）是重要的炎症阂子，在缺血性卒中的发生和发展中具有重要的作用心ｊ。在脑梗死治疗方面，溶栓、抗血小板等治疗方案均已成熟，唯有从抗炎方面入手的方法并不多见，而塞来昔布可显著改善内皮功能．降低氧化应激和炎症标志物水平【３］。本实验通过研究寨来昔布对动物模型脑梗死体积及梗死灶周围皮质ＭＣＰ一１表达的影响，进一步探讨塞来昔布的干预作用。

１材料与方法１．１材料

１．１．１

脑组织免疫组化切片制备用１０％水合氯醛深度麻

醉，快速断头取脑，在ｌＯ％的甲醛中固定６ｈ～８ｈ。在视交叉前

后１．５ｍｍ处关切取材。常规固定、脱水，二甲苯透明，浸蜡及

包埋。在切片机上连续切片。片厚４“ｍ。

１．２．４

免疫组化染色检测采用非生物素酶法。具体步骤参

照试剂盒说明书。显微镜下观察切片，ＭＣＰ一１阳性表达的细胞部位均呈棕黄色。显微镜下拍照，用电子计算机图像分析系统采集ＭＣＰ一１阳性细胞的平均灰度值。１．３统计学处理

药品与试剂氯化ｉ苯基四氮唑（２，３，５一ｔｒｉｐｈｅｎｙｈｒａ－用ＳＰＳＳ１８．０统计软件分析，数据以均数土

ｚｌｉｕｍｔｒａｚｌｉｕｍ

ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＴＴＣ。美国Ｓｉｇｍａ公司）；塞来昔布（辉瑞标准差（ｊ士ｓ）表示。采用方差分析和ｔ检验。

２结果

２．１

制药有限公司）；免疫组化检测试剂盒（博士德生物工程有限公

司）。

高脂血症大鼠模型

实验前７０只大鼠体重为（１１０士１０）ｇ。８周

１．１．２实验动物及分组选取４周龄．体重为（１１０±１０）ｇ健

２．１．１体重测定

康雄性Ｗｉｓｒａｒ大鼠７０只。山两医科大学生理实验室动物中心。随机分为４组：Ａ组为假手术组（”一１０）；Ｂ组为正常对照组（ｎ一２０）；Ｃ组为高脂组（ｎ＝２０）；Ｄ组为塞来昔布高脂组（ｎ一２０），Ａ组、Ｂ组普通饲料喂养８周，Ｃ组、Ｄ组高脂饲料喂养８周。实验前和８周后将大鼠禁食１２ｈ，鼠尾采血测定血脂水平。

１．２１．２．１

后．给予高脂饮食的大鼠，体重升至（３２５±２０）ｇ；而给予正常饮食的大鼠，其体重为（２４５±１０）ｇ，两者差异有统计学意义（Ｐ＜

０．０５）。

２．１．２血脂测定实验前正常饮食组和高脂饮食组血清

ＴＣ为（１．５ｌ±０．２３）ｍｍｏｌ／Ｌ和（１．５２士０．１３）ｍｍｏｌ／Ｌ，ＬＤＬ为

方法

（Ｏ．３６士０．０５）ｍｍｏｌ／Ｌ和（Ｏ．４１±０．２１）ｍｍｏｌ／Ｌ，无明显差异；

正常饮食和高脂饮食８周后．采用

８周后，两组ＴＣ为（１．５５±０．２３）ｍｍｏｌ／Ｌ和（３．０４士０．３９）

ｍｍｏｌ／Ｌ，ＬＤＬ为（０．３９士０．１１）ｍｍｏｌ／Ｌ和（１．８０士０．３２）

实验动物模型制备

改良线栓法ｈ制备大鼠大脑中动脉阻塞（ＭＣＡＯ）模型。大鼠苏醒后参照Ｌｏｎｇａ等０３５分制方法进行功能评分。其中１分～３分者为实验对象。ＭＣＡＯ

１

ｍｍｏｌ／Ｌ，高脂饮食组明显高于正常饮食组（Ｐ＜０．０５）。

２．２缺血ｌｈ／再灌注２４ｈ后各组大鼠脑梗死体积变化

ｈ再灌注１２

ｈ、２４

ｈ、２４ｈ及４８ｈ，Ｂ组、Ｃ

各组

组、Ｄ组根据再灌注时间分为１２ｈ和４８ｈ组，每亚组分别间再灌注２４ｈ脑梗死体积比相比有统计学意义（Ｐ＜０．０５）：Ｄ组（２４．０３±１．３５）ｏＡ明显小于Ｃ组（３２．１３士１．２２）％；Ｃ组明显大于Ｂ照组；Ｄ组明显大于Ｂ组（２０．６８土１．０９）％。

２．３对脑缺血侧皮质部ＭＣＰ一１含量的影响Ｃ组与Ｂ组相比?在缺血再灌注后各时间段ＭＣＰ一１的含量均明显增高（Ｐ＜

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０．０１）；Ｄ组与Ｃ组相比，在缺血再灌注后各时间段ＭＣＰ一１的

为５只、１０只、５只。各小组均于相应时间点断头处死。Ｄ组给予等渗盐水新鲜配制塞来昔布悬液２５ｍｇ／ｋｇ灌胃，２次／日，Ａ组、Ｂ组、Ｃ组在相同时间点给予等体积生理盐水。

１．２．２脑梗死灶测定

在每组再灌注２４ｈ亚组和假手术组中

各取５只造模成功大鼠，迅速断头取脑。将大鼠脑置于～２０℃

?３３６?ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＩＮＴＥＧＲＡＴＩＶＥＭＥＤＩＣＩＮＥＯＮＣＡＲＤＩＯ一／ＣＥＲＥＢＲＯＶＡＳＣＵＬＡＲＤＩＳＥＡＳＥＭａｒｃｈ２０１ＩＶ０１．９Ｎｏ．３

含量均有减少（Ｐ＜０．０５）。详见表Ｉ。

裹ｌ

ＭＣＰ一１在大鼠大脑皮质的平均灰度值（ｊ土ｓｌ

与Ｂ组相比，１）Ｐ＜０．０１；与Ｃ组相比，２）Ｐ＜０．０５

３讨论

高脂血症是脑卒中发病的高危因素之一。高脂血症不仅使组织易发生缺血性病变。而且当器官遭受缺血损伤时由于其所致的微血管功能障碍和组织损伤会使器官的脆弱性增强¨ｊ。有研究发现，与冠状动脉病变和周嗣血管病变相比，脑ｍ管与血脂异常的相关性较小。即脑血管内皮细胞对血脂升高所产生的危害并不敏感［７］。由饮食引起的高脂血症使脑微循环易遭受氧化应激并处于促炎症发生和促血栓形成的状态。高血脂对脑微循环的影响与其他组织器官是相似的【８］。临床上脑梗死患者多伴有血脂水平异常。根据这一特点．在高脂基础卜建谚脑缺血再灌注模型，从而建立起更接近人类实际情况的短暂性脑缺血再灌注模型，更有利于探讨高脂血症是否会加重脑缺血再灌注后脑组织的损伤程度。本实验显示脑缺血再灌注后高脂组的脑梗死体积增大，脑梗死灶周同ＭＣＰ—Ｉ表达增加，表明高脂血症可能会加重脑缺血再灌注后脑组织的损伤。

脑组织缺血后局部过度的炎症反应是造成损伤的主要原因之一。ＭＣＰ一１属于趋化因子家族中的成员（即ＣＣ亚家族）。对单核／巨噬细胞在受损部位的积聚发挥作用一。“。ＭＣＰ一１作为主要的单核细咆趋化因子，由受损的脑细胞产生，可趋化和激活单核细胞、小胶质细胞、Ｔ淋巴细胞等免疫细胞，以各种机制引起组织损伤。可通过多种机制促进动脉粥样硬化形成，而动脉粥样硬化又能从多种途径导致缺ｍ性脑卒中事件的发生，因此ＭＣＰ一１可通过促进动脉粥样硬化形成而引起缺血性脑卒中。ＭＣＰ一１可通过直接参与脑缺血后的炎症反应而引起脑组织损伤，是一种在脑缺血再灌注后脑内炎症反应发生过程中起重要作用的趋化因子““，对其进行研究及干预将有霞要的意义。本实验可见ＭＣＰ一１的表达与脑梗死体积的变化规律基本一致．这与国外报道一致，由此提示，ＭＣＰ—ｌ参与了炎症反应

过程。加重了脑组织的损伤。

塞来昔布是一种选择性的ＣＯＸ一２抑制剂，ＣＯＸ一２抑制剂的

脑保护作用主要与花生四烯酸环氧酶途径的代谢有关¨“。塞来昔布具有抗动脉粥样硬化的作用，其对血管壁的有益作用会超出其对前列环素的任何可能作用【Ｉ“。本实验显示塞来昔布可明显减小高脂大鼠的脑梗死体积．降低高脂大鼠梗死灶周围皮质部ＭＣＰ一１的含量，减小了脑缺血再灌注后脑组织的损伤程度，塞来昔布能有效地保护缺血／再灌注后脑组织损伤．减少

炎性细胞浸润及梗死体积。

参考文献：

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ｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ

ａｎｄｐｌａｑｕｅｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ

ｉｎｈｕｍａｎｃａｒｏｔｉｄａｔｈｅｒｏｓｃｌｅ—

ｒｏｓｉｓ［Ｊ＇］．ＪＮｅｕｒｏｓｕｒｇ．２００８．１０９（１）：８３—９１－

［２３

ＤｉｍｉｔｒｉｊｅｖｉｃＯＢ，ＳｔａｍａｔｏｖｉｃＳＭ。ＫｅｅｐＲＦ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅ

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