粗蛋白的测定

上传者：马雪芬
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上传时间：2015-05-04
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粗蛋白的测定

成品料及原料中粗蛋白质的测定

原料与成品中蛋白质的测定是饲料化验中特别重要的一项，目前国家标准中用于检测饲料中蛋白质的方法共有三种：1、凯氏定氮法；2、乙酰丙酮分光光度法；3、燃烧法。其中凯氏定氮法在饲料的蛋白质的测定中应用最广泛。下面主要介绍凯氏定氮法。

凯氏定氮方法简介：凯氏定氮法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质，后来由Gunning加入改进，在消化时加入K2SO4使沸点上升，加快分解速度，凯氏定氮法至今仍在使用。

凯氏定氮法所测得的含氮量为物质的总氮量，其中还包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐氮等，因此由凯氏定氮法测得的蛋白质称为粗蛋白质。

原理：原料或成品与催化剂和硫酸一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。其反应方程式如下：

蛋白质+ H2SO4 → （NH4） 2SO4

（NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4

NH4OH → H2O + NH3 → NH4OH

NH3+(标准) HCL→NH4CL

试剂和材料：蒸馏水，硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸，甲基红指示剂（C15H15N3O2），溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S），氢氧化钠，95%乙醇（C2H5OH），硼酸溶液，40%氢氧化钠溶液，盐酸标准滴定溶液（0.1mol/L），消化炉，凯氏定氮仪。

步骤：1、消化，2、蒸馏，3、滴定，4、计算。

1．消化过程：称取充分混匀的固体试样0.2g精确至0.001 g，移入干燥的消化管

中，加入3.2 g 催化剂及7mL 浓硫酸，放在消化炉上打开开关，整个消化过程需要2.5h。在此过程中混合指示剂是硫酸钾与硫酸铜以15:1的质量比混合的，其中硫酸钾的作用是可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程；硫酸铜的作用是在蒸馏过程中与氢氧化钠反应指示其加入量；硫酸起到强氧化剂的作用，与蛋白质反应生成硫酸铵，与蛋白质中的有机物反应生成CO2，SO2，H2O。

2．蒸馏过程：在250mL锥形瓶中加入50 mL 硼酸溶液，并使冷凝管的下端插

入液面下，根据试样中氮含量，向消化管中通如40%氢氧化钠溶液至溶液变黑，打开“汽”开关，开始蒸馏。

样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中：一是加入氢氧化钠溶液要过量；二是要防止样液中氨气逸出，防止氨气溢出的方法为硫酸铵校正，该方法为称取0.06g硫酸铵加入到消化管中，放在凯氏定氮仪上蒸馏，加入氢氧化钠的量大致在20~30mL。如果蛋白含量在21.19±0.2则说明氨气没有溢出。

3．滴定过程：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的硼酸进行氨的吸收，然后再用

标准盐酸溶液滴定从而计算出总氮量。以盐酸标准滴定溶液滴定至终点，颜色由蓝色变成灰红色。

在该过程中溶液颜色变化主要因为混合显色剂中甲基红和溴甲酚绿的变色区间一个为酸性一个为碱性，在氨气刚进入硼酸的时候溶液呈碱性，所以变为蓝色，在用盐酸逐渐滴定过程中随着盐酸将氨的中和溶液逐渐向酸性变化，在溶液变为灰红色的时候说明氨以完全消耗。

4．计算过程：

(V1 V2) c 0.014 6.25X 100

X 试验中蛋白质含量

V1 试样消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL

V2 空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL

c 盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L