人参总皂甙和西洋参茎叶总皂甙对贫血小鼠造血影响的比较_吕艳

2005年6月第28卷第2期??????????????????成都中医药大学学报

Jun.2005,Vol.28,No.2??????????????JournalofChengduUniversityofTCM??33??

人参总皂甙和西洋参茎叶总皂甙

对贫血小鼠造血影响的比较1221吕艳??祝彼得??冯雪梅??陈永锋

(1.??四川大学??华西基础与法医学院,四川??成都??610041;2.??成都中医药大学??基础医学院,四川??成都??610075)

????摘??要:??目的??观察人参总皂甙(TotalsaponinofPanaxGinseng,TSPG)和西洋参茎叶总皂甙(Panaxquin??quefoliumlsaponin,PNS)对贫血小鼠造血恢复的影响,并比较二者作用的异同。方法??采用Co60照射??注射环磷酰胺、氯霉素复合造模建立贫血小鼠模型,应用全自动血球分析仪和造血祖细胞体外培养技术,检测外周血和三系造血祖细胞集落。结果??TSPG与PNS都可以促进贫血小鼠骨髓有核细胞(BMC)和红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HB)、血小板(PLT)的回升(P<0??01或P<0??05),;对白细胞总数(WBC),TSPG与PNS显示相反的作用,TSPG有较弱的提升WBC的作用(P>0??05),PNS则抑制WBC的回升(P<0??05)。在造血祖细胞体外给药培养中,TSPG在25~100??g/mL范围内对三系祖细胞增殖都有促进作用,对红系、巨核系最适刺激浓度是25??g/mL,对粒系的最适刺激浓度是50ug/mL。PNS浓度为50~100??g/mL时对红系、巨核系有促进作用,其中巨核系作用冒险(P<0??01);25~50??g/mL时对粒系增殖没有明显影响,100??g/mL时则表现抑制作用(P<0??05)。结论??人参总皂甙和西洋参茎叶总皂甙都可以促进贫血小鼠造血功能的恢复,但其作用各有特点。

????关??键??词:??人参总皂甙;西洋参茎叶总皂甙;造血

????中图分类号:??R285??5;R556????文献标识码:A????文章编号:1004??0668(2005)02??0033??04

TheEffectofTotalSaponinofPanaxGinsengandPanaxquinquefoliumlSaponin

onHematopoiesisinAnemicMice

ZHUBi-de,LV-Yan,FENGXue-mei

(1??Schoolofbasicmedicalsciencesandforensicmedicalsciences,UniversityofSichuan,SichuanChengdu610041;2??Departmentofbiochemistryandmoleculebiology,Schoolofbasicmedicalsciences,ChengduUniversityoftraditionalChinesemedicineChengdu610075)

Abstract:Objective:TOcomparetheeffectofPNSonhematopoiesisinanemicmicewiththatofTSPG。Meth??ods:Anemicmicemodelresultedfrommyelosuppressionbyirradiationandcytotoxicchemotherapeuticcompoundswererandomlydividedintothreegroups:modlecontrolgroup,TSPGtreatmentgroup,PNStreatmentgroup。hematopieticpro??genitorcellscultureinvitroandperipheralbloodcountwereusedtodetectthenumbersofperipheralbloodcellsandCFU-GM,CFU-E/BFU-EandCFU-Meg??Results:BothofTSPGandPNScouldsignificantlypromotetheriseofRBC,HB(P<0??05)andBMC(P<0??01)??TSPGandPNSshowedadverseeffectonWBC??TSPGcouldslightlyincreasethenumbersofWBC(P>0??05),whilePNSdecreaseditinanemicmice(P<0??05)??ConcentrationofTSPGbetween25-100??g/mlcouldpromotetheproliferationofCFU-GM,CFU-E/BFU-EandCFU-Meg??Theoptimalconcen??trationforgrowthofCFU-E/BFU-EandCFU-Megwas25??g/mlandtheoptimalconcentrationforgrowthofCFU-GM50??g/ml??ConcentrationofPNSbetween25-100??g/mlhadanpositiveinfluenceonerythropoiesisandmagakary??opoiesis??ThoughPNSinlowconcentration(25-50??g/ml)showednoobviouseffectonthegrowthofCFU-GM,highconcentrationofPNS(100??g/mL)couldsuppressthegrowthofCFU-GM??Conclusion:BothofPNSandTSPGcanpromotehematopoiesisinanemicmicethoughtheyactindifferentway??

Keywords:TotalsaponinofPanaxGinsengandPanaxquinquefoliumlsaponin;hematopoiesis

????人参(Ginseng)和西洋参(Panaxquinquefoliuml)同为五加科人参属植物,是益气扶正、滋补强壮要基金项目:国家自然科学基金资助(批准号:30271661):,女,年4,;,,;:。

??34??

成都中医药大学学报??????????????????????????????2005年第28卷

药。其化学成分相似,药理作用相近。临床使用上也时常以西洋参替代人参。有关人参对正常和异常造血的影响已进行了广泛和深入的研究,涉及细胞、亚细胞和分子水平[1~3];而应用日益广泛的西洋参对造血影响却缺乏相关研究。本文采用外周血象检测和骨髓有核细胞造血祖细胞培养,比较了人参总皂甙和西洋参茎叶总皂甙对骨髓抑制性贫血小鼠造血的影响及差异,为西洋参的临床应用提供实验证据。

1??材料与方法1??1??材料和试剂

96/24孔培养板(Nunc公司),一次性针头式滤器(0??22umPall-Gelman公司),IMDM、培养基1640(美国Gibco公司),促红细胞生长激素(Erythropoitin)(成都地奥),IL-3??粒单系集落生长刺激因子(mGM-CSF)(Riche公司,德国),促血小板生长激素(Thrombopoietin)(R&D公司,美国),2-巯基乙醇??L-谷胺酰胺(美国Sigma公司),琼脂粉(Agar)(日本进口分装),环磷酰胺、氯霉素(上海第十二制药厂)。

人参总皂甙(TSPG,纯度99%)和西洋参茎叶皂甙(PNS,纯度95%)由四川省中药研究所提供,用1640培养基稀释配成浓度1mg/mL的工作液。1??2??设备

CO2培育箱(日本SANYO,MCD-15A型),超净工作台(北京半导体设备厂,JJT-900/1300型),电子分析天平(Sartorius,BP61型),相差倒置显微镜(重庆光学仪器厂,XDS-1型),高压灭菌锅(日本SANYO,LaboAutoclave),全自动血球分析仪(意大利HS-18型)。1??3??贫血小鼠模型

华西医科大学实验动物中心提供雄性BALB/c小鼠,体重20g??2g,8~12周龄,Co602??0Gy照射后第四日开始注射环磷酰胺40mg/kg氯霉素50mg/kg,Qid??3,造模完成。1??4??实验方法

1??4??1??红系祖细胞(BFU-E、CFU-E)培养

参照王勇等的方法[1]并做适当改进。将骨髓有核细胞悬浮于体系中,培养体系含25%马血清、10-5mol/l2-巯基乙醇、2u/mL人红细胞生成素(rHuEpo)、IL-32ng/mL、100u/mL青链霉素、0??3%琼脂,加入BMC使终浓度为1??105/mL,l,以每孔0??25mL接种到培养板(4个复孔),在37??、5%CO2、大于50个细胞为一个集落;CFU-E以大于8个细胞为一个集落;BFU-E、CFU-E用二甲氧基联苯胺染色。

1??4??2??粒系祖细胞(CFU-GM)培养

将骨髓有核细胞悬浮于体系中,培养体系含25%马血清、10~5mol/L2-巯基乙醇、鼠粒、单集落生长因子25ng/mL(mGM-CSF)、100u/mL青链霉素、0??3%琼脂,加入BMC使终浓度为1??105/mL,以每孔0??25mL接种到培养板(4个复孔),在37??、5%CO2、饱和湿度条件下培养7日计数集落数。CFU-GM以大于50个细胞为1个集落。1??4??3??巨核系祖细胞(CFU-Meg)培养

将骨髓有核细胞悬浮于体系中,培养体系含25%马血清、10-5mol/l2-巯基乙醇、2u/mL人红细胞生成素(rHuEpo)、IL-32ng/mL、2??5ng/mL鼠巨核细胞生长因子(mTpo)、100u/mL青链霉素、0??3%琼脂,加入BMC使终浓度为1??10/mL,,以每孔0??25mL接种到培养板(4个复孔),在37??、5%CO2、饱和湿度条件下培养7日计数集落数。CFU-Meg以大于3个细胞为1个集落,CFU-Meg用乙酰胆碱酯酶染色鉴定。

1??4??4??人参总皂甙和西洋参茎叶皂甙对贫血小鼠三系造血祖细胞的影响

(1)体内实验:将贫血小鼠随机分为3组,每组12只,分别是空白组??人参总皂甙组??西洋参茎叶皂甙组,造模完成后的第2天开始分别注射生理盐水(0??4mL/只)??人参总皂甙(0??5mg/mL,0??4mL/只)西洋参茎叶皂甙(1mg/mL,0??4mL/只)Qd??6,造模完成后的第8天检测外周血,处死动物测骨髓有核细胞(BMC)数,并做三系造血祖细胞培养,培养7日计数集落数。另设正常对照组测外周血和BMC。

(2)体外实验:取贫血小鼠6只,造模完成后的第2天处死,取股骨,冲出骨髓细胞反复吹打,过4#针头制成单细胞悬液,计数BMC并调整至所需浓度,做三系造血祖细胞培养,设7个组,分别是空白组(加入1640培养基)以及TSPG、PNS的低(终浓度25ug/mL)、中(终浓度50??g/mL)、高(终浓度100ug/mL)剂量实验组;分别培养7日计数集落数。1??5??统计学处理

各数据均以(x????s)表示,采用SPSS11??0软件进行统计分析。相同时间点贫血小鼠给药组,空白组,正常对照组之间的比较用t检验。比较两种皂甙对贫血小鼠造血恢复的影响。5

第2期????????????????吕艳等??人参总皂甙和西洋参茎叶总皂甙对贫血小鼠造血影响的比较????????????????35????

2??1??体内用药

人参总皂甙??西洋参茎叶皂甙对贫血小鼠外周血??骨髓有核细胞的影响外周血和骨髓有核细胞计数的结果显示(见表1),造模完成后的第7日,与贫血对照组相比,人参总皂甙(TSPG)和西洋参茎叶皂甙(PNS)对外周血RBC??HB和BMC的恢复都有促

进作用(P<0??05),对BMC的作用尤为明显(P<0??01);二者均显示对血小板(PLT)有提升作用,而对于WBC,TSPG对其略有促进作用(P<0??05),而PNS组的WBC却明显低于贫血对照组,并有统计学意义(P<0??05)。

表1??人参总皂甙??西洋参茎叶皂甙对贫血小鼠外周血及骨髓有核细胞的影响(??x??s)

组别正常组贫血对照组TSPG组PNS组

n14121212

WBC8??16??2??3891??8??0??452??1??0??411??56??0??4??

RBC11??4??0??728??44??0??539??26??0??869??02??0??54??

??

HB162??12128??9142??12138??9??

??

PLT901??64838??98922??1101052??112??

??

BMC10??2??1??26??91??0??788??3??0??72??7??2??1??38??

????

????,??P<0??05,????P<0??01

2??2??人参总皂甙??西洋参茎叶皂甙对贫血小鼠造血祖细胞培养的影响

2??2??1??体内用药对贫血小鼠造血祖细胞集落培养的影响(表2)

表2??人参总皂甙??西洋参茎叶皂甙??体内用药对贫血小鼠造血祖细胞集落的影响(??x??s)

Group贫血对照组TSPG组PNS组空白对照组1

CFU-GM19??924??12??16??682??5??32??5

CFU-Meg16??5??2??524??10????26??9??

??

细胞的生长(P<0??05),25??g/mL~100??g/mL浓度范围都有效,与空白组相比较,在粒系50??g/mL和100??g/mL两组作用有统计意义(P<0??05),50??g/mL组作用最强;对红系和巨核系25??g/mL、50??g/mL组有统计意义(P<0??05),25??g/mL组作用最强。在红系的体外培养中,加入25~50mg/mL浓度西洋参茎叶皂甙与对照相比显示有促进作用(P<0??05);巨核系体外培养中西洋参茎叶皂甙50??g/mL、100??g/mL组显示促进作用(P<0??05)。对红系、巨核系祖细胞生长50??g/mL组作用最强。低浓度(25??g/mL~50??g/mL)时对粒系无明显作用,高浓度(100??g/mL)则表现抑制倾向(P<0??05)。3??讨论

人参与西洋参为同科属植物,其主要药效成分为人参皂苷,但皂苷单体的组成比例上略有差异,人参中Rg1和Rb2的含量是西洋参的数倍,而西洋参中总皂甙和Rb1含量又是人参的数倍。人参与西洋

参另一明显区别在于西洋参中含有一定量的澳克梯隆醇型假人参皂苷24(R)-F11和人参皂苷-RAO,在人参中尚未发现[4,6]。本研究采用骨髓抑制性贫血小鼠作为研究对象,TSPG的有效注射剂量参考文献报道为10mg/kg,PNS的有效注射剂量基于预试结果为20mg/kg。人参和西洋参虽为同属补气药,但人参味甘微苦平,归脾、肺、心经,大补元气、复脉、固脱、补脾益肺。而西洋参味甘微苦,性凉、补气养阴、清热生津。人参重在补气,西洋参重在养阴生津[5]。本研究结果显示在对贫血小鼠造血恢复的影响上,二者各有其特点。腹腔注射的实验结果显示,TSPG与PNS都可以促进贫血小鼠BMC和外周RBC、HB、PLT升高,对白细胞计数(WBC),TSPG与PNS显

(下转第42页)????

BFU-E19??335??5????27??4??48??15

CFU-E47??15??69??19????54??17??118??33

26??11

????与贫血对照组比较,??P<0??05,????P<0??01

结果见表2,在体内用药中,人参总皂甙组对贫血小鼠三系造血祖细胞的增殖都有促进作用,对红系和巨核系作用显著(P<0??01),对粒系的作用稍弱(P<0??05);西洋参茎叶皂甙对巨核系造血的促进作用明显(P<0??01)。在红系的体外培养中,加入西洋参茎叶皂甙与对照相比显示有促进作用(P<0??05),粒系培养则表现抑制倾向(P>0??05)。2??2??2??体外用药对贫血小鼠造血祖细胞集落培养的影响(表3)

表3??人参总皂甙??西洋参茎叶皂甙体外用药对贫血小鼠造血祖细胞集落的影响(??x??s)

CFU-GMCFU-Meg

贫血对照组TSPG25??g/mLTSPG50??g/mLPNS25??g/mLPNS50??g/mLPNS100??g/mL

13??622??328??3??

??

BFU-E16??426??6??19??7??18??421??6??20??7??17??2

CFU-E67??2191??36??83??25??71??2375??2188??27??71??23

15??5??723??8??20??5??2??5??

16??716??5??1029??16????26??15??6??

TSPG100??g/mL27??4

15??714??412??5

????与贫血对照组比较,??P<0??05

结果如表3显示,人参总皂甙直接加入在含集落刺激因子的培养体系中,能明显促进三系造血祖

??42??

成都中医药大学学报??????????????????????????????2005年第28卷

于对照组10%~15%,有显著性差异。说明造模成功且稳定。

2.4??实验动物Ghrelin水平的变化(表3)

组别例数对照组10模型组10

餐前Ghrelin水平

(pg/ml)824??88??503??02????????431??67??224??07??????

餐后Ghrelin水平

(pg/ml)113??49??107??5885??32??35??49

机理研究中,近年来发现的Ghrelin[3]尤其应当重视。因为它是近年来科学家发现的一种在胃内分泌的生长激素促分泌素受体的内源性配体,它能增强食欲,调节能量平衡,其浓度增加可引起觅食行为。作为主要临床表现的食欲减退可以摄食量及体重变化来评估,但有时摄食量的变化是因为特制饲料乃高蛋白饲料,少量即可提供足够能量需求,不能直接反映食欲情况;本实验表明,模型组餐前Ghrelin水平明显低于对照组,与以上评价指标是一致的,故而认为Ghrelin水平变化可佐证食欲变化情况。

通过本实验表明,病因模拟法建立是小儿厌食症动物模型可行的,将摄食量、体重、Ghrelin水平综合评价,似更为全面、科学。

参考文献

1??陈小野??实用中医证侯动物模型学[M]??北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1993:47

2??汪受传,尤汝娣,郁晓维,等??运脾方药治疗小儿厌食症个临床与实验研究[J]??中西医结合杂志,1991,11(2):753??KojimaM,hosodaH,DateY,etal??ghrelinisagrowth-hor??mone-reasingacylatedpeptidefromstomach[M]??Nature,1999,402(6762):656-660

(收稿日期:2005??02??17)

与对照组比,??P<0??05;餐前与餐后比,??????P<0??001

两组餐前Ghrelin水平明显高于餐后,进餐后

Ghrelin水平明显降低;对照组餐前Ghrelin水平明显高于模型组,餐后两组水平无明显差异,说明餐前Ghrelin水平可能是影响食欲的最主要因素。3??讨论

一般认为病因、症状和治疗反证是建立中医证候动物模型的三要素。小儿厌食症的主要病因是喂养不当,膳食结构不合理,造模因素容易被模拟;小儿厌食症的主要证候脾运失健证以长期食欲减退为临床表现,症状单纯,用进食粮、体重等指标即可评价;运脾复方治疗小儿厌食症已取得可靠疗效

[2]

,可

以作为有效方药反证模型。本实验表明,用本法建立小儿厌食症动物模型在进食量、体重等指标是符合厌食症诊断标准的。同时,在探究厌食症的众多

????(上接第35页)

示相反的作用,TSPG对提升WBC作用较弱(P>0??05),PNS则抑制WBC的回升(P<0??05)。实验动物的造血祖细胞培养结果显示,TSPG和PNS对外周血的影响与其对粒、红、巨核三系祖细胞增殖的促进作用有关,王亚平的研究证实这种促进主要是通过一些间接的方式,比如调控造血微环境中基质细胞分泌造血生长因子得以实现的。

将TSPG直接加入造血祖细胞体外培养体系的结果显示,TSPG对三系造血祖细胞的集落形成有直接的刺激,这与前人报道TSPG有类造血生长因子或生长协同因子的报道相符;二者都显示对TSPG对CFU-GM作用稍弱;而西洋参茎叶皂甙对实验动物造血祖细胞生长促进主要表现在红系、巨核系造血,对巨核系造血可能既有直接作用又有间接作用,对粒系造血似无明显影响,高浓度的西洋参茎叶皂甙甚至对粒系造血产生抑制。另外,TSPG与PNS对造血影响的最适浓度也有差异。TSPG在25~100??g/mL范围内对三系祖细胞增殖都有促进作用,对红系、巨核系最适刺激浓度是25??g/mL,对粒系的最适刺激浓度是50??g/mL。PNS在浓度为50~100??g/

[10]

mL时对红系、巨核系有促进作用,其中巨核系作用明显;25~50??g/mL时对粒系增殖没有明显影响,100??g/mL时则表现抑制作用。

参考文献

1??王勇,祝彼得,王亚平??人参总皂苷体外刺激小鼠造血作用机制研究[J]??中华血液血杂志,1995,12:648

2??方桂伦,高瑞兰??人参总皂甙对小鼠造血祖细胞的刺激增殖作用[J],浙江医学,2000,7:26

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(收稿日期:2004??11??09)