高生存期肺癌患者外周淋巴细胞染色体及肺癌组织比较基因组杂交回顾性分析

!+(《中国癌症杂志》"&&,年第!,卷第’期

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高生存期肺癌患者外周淋巴细胞染色体及肺癌组织比较基因组杂交回顾性分析

"熊玮!，#钱桂生"

!$第三军医大学附属西南医院呼吸科，重庆%&&&’(；

"$第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆%&&&’)

##［摘要］#背景与目的：肺癌染色体异常与临床反应及临床预后密切相关。通过对肺癌手术后高生存期患者外周血淋巴细胞和肺癌组织进行染色体分析，为肺癌发生发展相关基因的筛选及肺癌临床治疗奠定基础。方法：选择肺癌高生存期组术后生存*年以上的肺癌患者"&例，其中鳞状细胞癌+例、腺癌,例、小细胞癌*例。肺癌对照组随机选择术后!年内患者"&例，其中鳞状细胞癌(例、腺癌)例、小细胞癌*例。正常对照组选择健康志愿者"&例。常规法进行以上’组患者的外周血淋巴细胞中期染色体分析。肺癌高生存组和肺癌对照组选择石蜡组织包埋块提取基因组-./，-012304法进行567分析。结果：高生存期组外周血淋巴细胞染色体畸变发生率为’$!*8，显著低于肺癌对照组的!&$(*8（!9&$&!），染色体畸变主要为染色体单体裂隙、断片、无着丝粒片段，偶见衍生染色体。567分析结果显示，高生存期组有,例未见任何染色体畸变发生，肺癌对照组有!例未见染色体畸变发生。高生存期组畸变染色体平均数目（"$,&:!$(*）显著少于肺癌对照组（*$!&:"$!’）。结论：染色体畸变少的肺癌患者预后好、生存期长，肺癌临床高生存期可能与染色体遗传稳定性相关。

［关键词］#肺癌；#染色体；#比较基因组杂交

中图分类号：;)’%$"##文献标识码：/##文章编号：!&&)<’,’+（"&&,）&’<&!+(<&%

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##肺癌作为最常发生的恶性肿瘤之一，己成为人

通讯作者：钱桂生#Y<G@3B：Z3@A6[\G@3B$DGGK$F?G$FA类死亡的主要病因之一。尽管肺癌的治疗手段，包括手术、放疗、化疗等，均有明显改进，仍然只有不到!*8的患者能存活*年以上。临床上高生存期患者

《中国癌症杂志》())+年第!+卷第,期

［!］

可能存在着与短生存期患者不同的染色体变异，

!**

照EBO:;BC法，具体如下：

!&,&(&!%设置对照%用已标记的光谱绿54K+))作阳性"#$对照，用正常EFG作阴性对照。!&,&(&(%正常中期带"#$靶载玻片%采用OPC;C公司所售的正常中期带"#$靶载玻片，这种染色体载片已经过标准的细胞遗传学载玻片准备方法处理，染色体长度为0))-’’)横纹，是使用核型正常的男性或女性志愿者的外周血淋巴细胞，采用同步拦截法培养制备而成。

本研究用比较基因组杂交技术（"#$）分析临床高生存期肺癌患者染色体变异情况，分析临床肺癌高生存期有关的染色体变异部位，为下一步相关基因的筛选奠定基础。

!%材料和方法

!&!"一般资料"研究对象选择于重庆西南医院、新桥医院或大坪医院。肺癌高生存期组选择临床经过手术化疗放疗等综合治疗后、生存’年以上肺癌患者()例。其中鳞状细胞癌*例、腺癌+例、小细胞癌’例，患者年龄,*-+.岁，平均’!岁。手术后距今生存时间’-!,年，平均*&’年。肺癌对照组选择临床经过手术化疗放疗等综合治疗不到!年的患者()例。其中鳞状细胞癌.例、腺癌/例、小细胞癌’例，患者年龄,.-+/岁，平均0*岁。正常对照组选择健康志愿者()例，年龄0)-/)岁，平均’(岁。

!&#"外周血淋巴细胞中期染色体分析［#］

%无菌条

件下抽取各组受试者外周血012。立即置于3452!+0)培养液中,/6恒温培养箱中培养+-*7，加入秋水仙素液（!)!8912）)&(12，继续培养(-,7后将培养物吸入离心管内，!))):91;<离心.1;<，用吸管小心吸掉上清液。将预温,/6的低渗液（)&)/’1=29>?">溶液）’12加入离心管中，用吸管混匀后放入,/6水浴锅中低渗处理(’1;<。取出离心管，加入!12新鲜固定液（甲醇：冰醋酸按,@!配制），缓慢混匀，常规法置备染色体片。将标本片在!A#;B1CD染液中染色!)1;<，自来水轻轻冲洗，空气干燥。显微镜下观察、照相、分析核型。!$%"肺癌组织块&’(分析

!&,&!%石蜡包埋肺癌组织块基因组EFG的提取与鉴定%肺癌高生存组和肺癌对照组选择石蜡组织包埋块进行检测，提取基因组EFG。EFG提取方法的

主要步骤参照#=B2H的方法［,］：切除多余石蜡，暴露

组织。将组织切碎（最大径I)&’11），称重。溶于JK提取液，混匀，于0.6放置(07。加入蛋白酶?至终浓度218912，LEL至(A，温育0)7。用等体积酚氯仿溶液提取,次。(&’倍体积乙醇沉淀EFG。M/)6放置(-07，*)))8离心!7。沉淀物用/)A乙醇洗!次，干燥后用JK（N$/&(）溶解。基因组EFG含量及纯度测定采用紫外分光光度计测!值法及琼脂糖凝胶电泳观察。

!&,&(%石蜡包埋肺癌组织块基因组"#$分析%参

!&,&(&,%缺口平移法标记基因组EFG%)&(11=29>光谱绿或光谱红QRJ4标记EFG。

!&,&(&0%制备混合探针%将!)!（2())<8）光谱绿

缺口平移标记的EFG，!!（2!))<8）光谱红总基因组参考EFG，!)!（2!)!8）人类"SJTEFG加入离心管中。加(&!!（2!9!)体积）,1=29>乙酸钠，后加’(&’!（2(&’倍体积）无水乙醇沉淀EFG。简单涡旋，置干冰上!’1;<。!())):91;<，06离心,)1;<以沉淀EFG。,!!纯水和/!!"#$杂交缓冲液重悬沉淀。/,6水浴加热探针混合物’1;<使探针变性。

!&,&(&’%探针与染色体中期带原位抑制杂交%/,6变性溶液中正常中期带的载玻片浸入’1;<。载玻片经序列乙醇脱水，/)A、.’A、!))A乙醇溶液各!1;<。干燥后加!)!2变性探针于载玻片上，,/6杂交0.-/(7。

!&,&(&+%漂洗载玻片%将载玻片放入/,6的)&0ULL"9)&,AF4T0)洗液中!-,秒钟U(次，将载玻片立放(1;<。将载玻片放入室温的(ULL"9)&,AF4T0)洗液中!-,CU(次，避光干燥。!&,&(&/%杂交显影%向每个杂交区加!)!!EG4"复染剂和加盖盖玻片。

!&,&(&.%荧光显微镜观察和图像分析%参照4;NB:

等［0］方法进行。以荧光显微镜检测每条染色体上

的两种荧光信号，并用与荧光显微镜相连的冷数字""E照相机摄取荧光杂交图，随后通过计算机软件处理，计算两种荧光杂交信号的比值。根据两种荧光信号比值的变化来判断染色体的扩增与缺失。!&)"统计学处理"L4LL!)&)统计学软件处理，V;C7B:确切概率及"检验。

(%结%%果

#&!"外周血淋巴细胞培养染色体分析"高生存期组()例患者外周血淋巴细胞培养染色体分析显示：染色体畸变发生率为,&!’A，明显低于肺癌对照组

(""

熊玮，等Y高生存期肺癌患者外周淋巴细胞染色体及肺癌组织比较基因组杂交回顾性分析

的!"#$%&（!’"#"!），也明显低于文献报道的肺癌畸变水平。染色体畸变主要为染色体单体裂隙、断片、无着丝粒片段，偶见衍生染色体（见图!和图(）。正常对照组外周血染色体畸变发生率很低，仅为!#%%&（见表!）

。

表!"各组外周血染色体畸变发生情况)$*+!",-(./.0./$1$*&(($23.4.516/7-.%62&0

=*=27+/0<9=4:0;3/07+/0<9，!’"#"!；:：:0;3/07+/0<9=4!(LM!#"$，;0/127+/0<9，!’"#"!#!(L!A$#I(，

#+#"石蜡包埋肺癌组织块基因组:;<提取结果,石蜡包埋肺癌组织所提取的基因组NED片段均有不同程度的降解，但大部分仍为大片段。经"#I&琼脂糖凝胶电泳分析表现为鼠尾状条带，紫外分光光度仪检测D(K"OD($";1比值在!#IP

图!"高生存期组淋巴细胞染色体片，见染色体单体断裂)*+#!,-./012304015067819.0:835*;70;+4</=*=27+/0<9，10>

;015:/5=*:5?24455;

（@A"

）

!#$%之间，说明所提取NED纯度较高。

#+="石蜡包埋肺癌组织块基因组:;<,>?分析结果,-CQ分析结果显示，高生存期组("份肺癌标本中，有K例未见任何染色体畸变发生。肺癌对照组("例患者中有!

例未见染色体畸变发生。两组统计学比较有显著区别（!’"#"%）。高生存期组畸变染色体平均数目为(#K"R!#$%，显著少于肺癌对照组的%#!"R(#!H。结果见表(。具体染色体畸变情况见表H。

表#"肺癌石蜡组织基因组:;<,>?分析)$*+#":;<,>?$4$16030.57$($553407&%3/&4

图#"高生存期组淋巴细胞染色体片，偶见染色体无着丝粒

片断（$%&）及衍生染色体（’&(）

)*+#(,-./012304015067819.0:8354*;70;+4</=*=27+/0<9，

:5;3/015/52;BB5/*=23*=5:./0104015?5/5/2/5455;

（@A"）

=*=27+/0<9=4:0;3/07+/0<9，"LA#H"A，!’"#"!#

表="肺癌高生存期组,>?分析染色体畸变情况

《中国癌症杂志》533’年第0’卷第!期530

组53例患者肿瘤组织染色体畸变发生少，有’例未发现任何染色体畸变，发生畸变的06例患者中，涉及的染色体变化区域较少。在各类型肺癌中，同一部位有两例或两例以上发生变化的染色体有：鳞癌的!4、24扩增，54缺失；腺癌的04扩增，)4缺失以及小细胞癌的!4和&*扩增。我们考虑可能这’例肺癌染色体畸变范围小（扩增C033:G或缺失C!%G）或发生了不改变染色体数量的易位和复杂重排，用>HI分析不能发现，需使用其它技术才能检!"讨""论

临床资料显示，仅仅依据#$%分期不能准确判定某些肿瘤的疗效及预后，分子肿瘤学研究证实，某些常见染色体异常与临床反应、预后因素之间密切相关。不同肿瘤与临床反应、预后相关的染色体变

［&，’］

异的区域有差异。肺癌染色体异常对临床预后

的影响也倍受关注，研究发现染色体畸变数量与临床预后呈负相关，典型和非典型类癌基本无染色体变化，其预后较好，而小细胞肺癌和大细胞神经内分

泌癌常存在大量的染色体畸变，其预后较差［(］。在

早期非小细胞肺癌中，)*上等位基因的失衡是病情

进展有价值的指标。+,-.等［/］分析)0例1期非小

细胞肺癌标本的微卫星不稳定性（%2）时发现，!0例患者在03456上有%2发生，其中的03例患者在手术后&年内即死于肺癌，而&/例无%1者仅)例在手术后&年内死于肺癌，提示03456的%2与临床短

生存期相关。789:;等［)］发现，存在!*杂合性缺失的肺腺癌患者的生存时间明显缩短。*<;等［03，00］则

报道在$=>?>中有!@、’4重排者，其临床预后较好，而6号和55号染色体丢失常预示预后较差；在鳞癌和小细胞癌中，若频繁出现034缺失，则提示肿瘤进展或己发生转移。

本实验以53例临床高生存期肺癌患者为研究对象，分析了其外周血和肿瘤组织染色体的畸变情况，对照组选择一般的肺癌患者，主要基于以下考虑：研究高生存期肺癌患者与一般肺癌患者的染色体差异；考虑到同时分析外周血淋巴细胞染色体变化，故选择现存活的肺癌术后患者，在肺癌对照组中可能混有少数“潜在的高生存期患者”，对肺癌对照组的影响应该不大。外周血畸变分析发现，肺癌手术后高生存期的患者外周血染色体畸变很少，发生率仅为!A0&B，明显低于肺癌对照组（!C3A30），仅表现为少量的染色体单体裂隙、断片、无着丝粒片段，偶见衍生染色体。但其畸变发生率仍高于正常对照组，有待进一步研究。本研究用石蜡包埋肺癌组织提取基因组D$E，发现D$E大部分为较大片段，但都有不同程度降解，在进行D$E荧光探针标记时，应缩短酶处理时间，以避免D$E被酶切得太短。只有保证探针长度在!33F!333G@之间，才能确保>HI分析的成功。我们的体会是酶处理时间最好为63F’3J;K。>HI分析结果显示，高生存期

测。结合高生存期组畸变染色体数目平均为（5A’3L0A/&），显著少于肺癌对照组的（&A03L5A0!）。可以推测，肺癌患者临床高生存期可能与染色体遗传稳定性相关，染色体畸变少的肺癌患者预后好、生存期长。考文献］

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［5］"刘权章A人类染色体方法学［%］A第0版，北京：人民卫生

出版社，0))5：5(5V5(!A

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（收稿日期：533&V3’V53"修回日期：533&V03V!0）

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