微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成_R_氰醇的研究

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生物化学与生物物理进展　　Prog.Biochem.Biophys.　　　　　2001;28(4)

微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成(R)-氰醇的研究＊

刘森林　宗敏华

＊＊

　涂　然　周　番

(华南理工大学生物工程系,广州510640)

摘要　利用气相色谱手性分析,研究了微水相中来源于杏仁的(R)-醇腈酶催化醛与HCN不对称合成(R)-氰醇.结果表明,反应时间、添加乙酸、反应介质、反应体系水活度、反应温度和底物的结构对醇腈酶反应均有显著影响.杏仁醇腈酶对芳香族、脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用.其中,苯甲醛为杏仁醇腈酶的最适作用底物,在低温(0～5℃)下,转化率和产物对映体过剩值均在99%以上.关键词　微水相,杏仁醇腈酶,不对称合成,(R)-氰醇学科分类号　Q556.1

　　不对称生物合成与转化是90年代以来国内外生物工程学和有机合成化学最为活跃的研究领域之

一.光学活性氰醇是一类重要的手性合成中间体,它很容易转化为α-羟基酸(酯)、α-羟基醛(酮)、α-氨基酸、β-胺基醇和邻二醇衍生物等多种具有重大应用价值的手性中间体[1].这些中间体不仅为现代不对称合成研究提供了富有学术价值的光学活性构体,而且本身还是能够产生巨大商业价值的重要医药和农药中间体[2].因此,在不对称合成领域中,光学活性醇腈的合成堪称颇具挑战性的课题.各种化学和生物方法相继见诸报道

[3,4]

的影响.

1　材料和方法

1.1　材料

　　杏仁醇腈酶为市售苦杏仁粉碎后经乙酸乙酯脱

脂制得的粗制酶制剂[6];HCN由KCN与乙酸反应制得;内标正十四烷购自Sigma公司;其他化学试剂均为市售分析纯.

1.2　方法1.2.1　有机溶剂脱水:将0.4nm分子筛于180℃干燥箱内活化2h,置干燥器中冷却后,加入有机溶剂(除在研究有机溶剂的影响时用到其他有机溶剂外,均用异丙醚为有机溶剂)中,室温振荡48h,滤去分子筛,得脱水有机溶剂.

1.2.2　水活度的控制:酶反应前,将酶冻干后,与底物、反应介质分别置于密闭容器中,对不同盐的饱和水溶液气相平衡72h,使酶及反应介质的水活度与饱和盐水溶液的水活度相同.LiCl(αw=0.12),MgCl2(α32),Mg(NO3)w=0.2·6H2O(αw=0.55),NaCl(αw=0.75),KCl(αw=0.86),H2O(α1).w=1.2.3　醇腈酶催化不对称合成反应:在50ml带塞三角瓶中装入10ml含有750mmol/LHCN、300mmol/L醛的脱水有机溶剂,添加90μl正十四烷(内标)、预定量的乙酸于其中,加入1.5g酶

　＊广东省自然科学基金资助项目(980543).＊＊

　通讯联系人.

　Tel:020-87111452,E-mail:senlinliu@http://wendang.chazidian.com:-,-,归纳

起来主要包括:手性底物诱导的氰基对手性醛(酮)的不对称加成反应;手性催化剂诱导氰基对

潜手性醛(酮)的不对称加成生成光学活性氰醇;外消旋体氰醇的拆分等.其中,醇腈酶(oxynitrilase/hydroxynitrilelyase,E.C.4.1.2.10)催化醛与HCN不对称合成光学活性氰醇的方法,因其在反应条件、产物得率、光学纯度和底物适用范围等方面均较其他方法胜出一筹,故成为该领域的研究热点[5].醇腈酶催化不对称合成手性氰醇的研究在酶反应条件的优化、新反应体系的建立、酶反应的立体专一性、区域选择性、底物适用性等方面均值得研究和探讨.迄今,尚未见系统研究微水相中各种反应条件对醇腈酶催化不对称合成手性氰醇的报道.本文研究了微水有机相中来源于杏仁的(R)-醇腈酶催化醛与HCN不对称合成(R)-氰醇,并系统探讨了微水有机相中添加乙酸、有机

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制剂开始反应,于预定温度,120r/min水浴振荡.定时取样0.1ml.

1.2.4　转化率、反应速度及产物光学纯度的测定:向0.1ml样品中加入60mmol/L吡啶和60mmol/L乙酸酐,于30℃条件下酯化3h(产物氰醇99%以上转化成相应的酯).衍生样品供气相色谱分析.采用内标法计算底物和产物的量(内标为正十四烷).根据底物醛的减少计算转化率,以初始反应时间内,醛在单位时间内的减少量计算初始反应速度,根据衍生产物酯两种异构体的量,计算光学纯度(用对映体过剩值ee%表示).对映体过剩值ee%=(A-B)/(A+B)(其中:A、B分别表示反应后氰醇衍生物酯两对映体R、S的量).1.2.5　气相色谱分析.仪器:HP4890D气相色谱仪,配备3398A工作站,氢火焰离子检测器;手性柱:β-Cyclodextrin柱,柱径0.32mm,柱长30m(美国惠普公司).分析条件:气化室温度:260℃,检测室温度:300℃,柱温:120℃维持2min后,5℃/min升温至180℃;载气:氮气,流速为2.3ml/min;分流比:1∶100;进样量:1μl.

转化率基本不变,而产物的光学纯度逐步下降.这是由于生成的光学活性氰醇进一步外消旋化之故.可见,选择适当的反应时间对获得高转化

率的同时得到较高的光学纯度至关重要.2.2　添加乙酸对酶反应的影响

　　在10ml异丙醚为反应介质的醇腈酶反应体系中,分别添加不同量的乙酸,反应进行6h和12h的转化率和产物对映体过剩值ee%分别列于表1.

Table1　Effectofaceticacidonenzymaticreaction

V(Aceticacid)

pH

/μl

050100150200300400500

=25℃.

6.44.94.74.54.34.03.73.5

　t=6h

　t=12h

Conversion/%ee%Conversion/%ee%

62878286

69848684807874

95979898989898

87878887868686

93959897979797

[7]

reactionmedium:10mldiisopropylether;substrate:benzaldehyde;t

2　结果与讨论

2.1　反应过程曲线

　　在10ml含有150μl乙酸、水活度为0.86的异丙醚中,常温(25℃)下,来源于苦杏仁的

(R)-醇腈酶催化苯甲醛与HCN不对称合成(R)-氰醇的反应过程曲线如图1所示.反应前2h

,

结果表明,在不添加乙酸的情况下,产物的光学纯度较低(ee%为87%);当向反应体系中添加适量的乙酸时,由于乙酸抑制了HCN解离成有利于非

酶反应的CN-1离子,从而大大降低了生成外消旋产物的非酶反应,因此,产物的光学纯度显著提高.同时,添加乙酸也可影响酶反应的速度.当添加乙酸量较小时,随着乙酸量的增加,醇腈酶反应速度不断增加;当添加乙酸量较多时,酶反应速度反而有所下降.这是由于能生成氢键的乙酸可代替酶分子表面的部分水充当酶分子的润滑剂,使酶活性中心的极性和柔性增大,并通过非共价作用力来维持其催化活性构象,从而提高酶的活性[8].然而,过量的乙酸又可降低酶周围微环境的pH值,改变酶活性部位上有关基团的解离状态,改变酶分

Fig.1　Reactiontimecourseoftheasymmetricsynthesisofchiralcyanohydrincatalysedby(R)-oxynitrilasefrom

benzaldehydeandhydrogencyanide

◇———◇:conversion;□———□:ee%

子的活性构象,故酶的活性反而有所下降.而且,

由表1可见,乙酸量在150μl以上时对转化率和产物ee%影响不大,这是由于乙酸对反应平衡点影响甚微,而添加150μl乙酸足以抑制非酶反应之故.另外,由于乙酸酸性较弱,添加适量的乙酸对酶的稳定性影响甚小.综合考虑反应速度和产物的光学纯度等因素,乙酸的添加量以150μl左右为宜.

2.3　有机溶剂对酶反应的影响

,转化率随反应时间直线上升,对映体过剩值(ee%)高达99%以上;此后,酶反应速度逐渐下降,至反应12h,反应达到平衡,转化率和产物

ee,

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重要作用.它不仅影响反应平衡点和酶反应的对映体选择性,而且酶在不同有机溶剂中的活性也有显著差异(表http://wendang.chazidian.comnne等[9]通过研究发现,脂肪酶

活性与有机溶剂的疏水性(用一种溶剂在辛醇/水两相之间分配系数的常用对数值,即lgP表示)有密切的关系,当选用疏水性较强的有机溶剂时,酶具有较高的活性.本研究选用不同疏水性的5种有机溶剂作为醇腈酶反应介质.结果发现,微水有机相中醇腈酶活性并不符合上述lgP规律.在本研究范围内,醇腈酶在疏水性最弱的乙酸乙酯中活性较低,但在疏水性较弱的异丙醚中,酶反应速度、转化率和立体选择性较疏水性较强的甲苯、环己烷和正己烷均胜出一筹.可见,有机溶剂特性对非水相酶反应的影响因酶类的不同而异.

Table2　Effectoforganicsolventsonenzymaticreaction

Etheractate

lgPv/mmol·L-1·h-1

t/hConversion/%

ee%

0.68612996

Diisopropyl

TolueneCyclohexaneHexane

ether1.984128898

2.555245496

3.030242691

3.531242790

反应速度和产物的光学纯度均随体系水活度的增加而迅速增加.但当水活度超过0.86后,酶反应速度反而有所下降.故该反应体系的水活度以0.86左右为宜.

Fig.2　Effectofwateractivityenzymaticreaction

reactionmedium:10mldiisopropylether,150μlaceticacid;substrate:benzaldehyde;t=25℃.◇———◇:conversion;

□———□:ee%.

2.5　反应温度对酶反应的影响

　　温度可影响醇腈酶反应速度,但更重要的是影响最终转化率和产物的光学纯度(表3).温度适

Table3　Effectoftemperatureonenzymaticreaction

t/℃

051015253550

v/mmol·L-1·h-1

15

2128326780100

t/h4848484824126

Conversion/%

>99

>999897887965

ee%>99>999999989692

reactionmedium:10mlorganicsolvent,150μlaceticacid;substrate:benzaldehyde;t=25℃.

2.4　水活度对酶反应的影响

　　酶蛋白的水化作用是维持酶催化活性构象的必要条件.完全没有水,酶的催化作用不可能发生.在微水有机相酶反应体系中,尽管水含量很低,但总有一部分与酶分子紧密结合的水化层,将酶分子与大量可使酶失活的有机介质隔离开来,以维持酶的活性.而且,酶蛋白的结合水可削弱各极性残基间的相互作用,使其彼此分开,增大酶活性位点的柔性,降低酶与底物间形成过渡态的能阀,故酶的水化作用可提高酶的活性.然而,过量的水则可能在酶分子周围形成水簇,影响传质,导致酶反应速度降低.为了揭示反应体系水活度对醇腈酶催化不对称合成氰醇的影响,作者比较了在不同水活度的反应体系中的酶反应(图2).由图2可见,当体系水活度小于0.55时,酶反应速度和酶反应的立体选择性均较低.这是因为水活度较低时,反应体系中的水不足以形成酶发挥催化功能所需的水化层,酶分子未被活化,酶反应速度较低,而无立体选择性的非酶反应速度一定,故产物光学纯度也较

低,reactionmedium:10mldiisopropylether,150μlaceticacid;

substrate:benzaldehyde;wateractivity:0.86.

当降低,酶反应速度有所下降,而转化率和产物光

学纯度均有显著提高.当温度从50℃下降到15℃,转化率从65%增加到97%,产物ee%从92%提高到99%,而转化率和产物ee%在0～5℃时均高达99%以上.这是由于醇腈酶促不对称合成反应是一放热反应,温度降低有利于反应平衡向氰醇合成的方向移动,故平衡转化率不断提高.同时,醇腈酶反应的活化能较无立体选择性非酶反应的活化能低得多.提高温度,活化能较高的非酶反应速度增加的幅度比活化能较低的酶反应大得多.换言之,温度升高有利于活化能较高的非酶反应,而温度降低则有利于活化能较低的酶反应.即在较低温度下,醇腈酶反应速度远远大于无立体选择性非酶反应的

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速度,故可获得较高的光学纯度.可见,为获得高转化率和高光学纯度,应选择低温0～5℃为佳.2.6　底物醛的结构对酶反应的影响

　　来源于杏仁的醇腈酶对底物有较强的特异性.在以不同的醛为底物时,醇腈酶反应的转化率和产物的光学纯度存在较大的差异.为了研究醇腈酶对醛结构的特异性,作者比较了微水有机相中其催化7种不同的醛与HCN不对称合成(R)-氰醇(表4).结果表明,芳香族、脂肪族和杂环族醛均

Table4　Effectofsubstratestructureonenzymaticreaction

　Substratebenzaldehyde

p-hydroxybenzaldehydep-anisalclehydephenylpropionaldehyden-butyicaldehyden-hexanaln-octoicaldehydefurural

t/h48689170487512048

Conversion/%

>9964828895723394

ee%>9996979698966898

着脂肪醛碳链的增长,HCN亲核进攻醛与醇腈酶复合物中间体的空间障碍增大[10],导致酶反应速度降低.

参　考　文　献

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reactionmedium:10mldiisopropylether,150μlaceticacid;wateractivity:0.86;t=0℃.

是杏仁醇腈酶的良好底物.而苯甲醛是杏仁醇腈酶

的最适作用底物,其在反应速度、转化率和立体选择性等方面较其他醛均胜出一筹.这是由于杏仁醇腈酶的天然作用底物为苯甲醛之故.同时,我们发现,对脂肪族醛而言,底物醛的碳链长短对醇腈酶反应有显著影响.正丁醛为底物时的转化率和光学纯度均高于正辛醛为底物时的相应值.这是因为随

StudyontheAsymmetricSynthesisof(R)-CyanohydrinsCatalysedby

＊

(R)-OxynitrilasefromAlmondinMicro-aqueousPhase

(DepartmentofBiotechnology,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640,China)

＊

LIUSen-Lin,ZONGMin-Hua＊,TURan,ZHOUFan

Abstract　Asymmetricsynthesisof(R)-cyanohydrinsfromaldehydesandhydrogencyanideusing(R)-oxynitrilasefromalmondinmicro-aqueousphasewasstudiedbyGCchiralanalysis.Reactiontime,contentof

aceticacid,reactionmedium,wateractivity,reactiontemperatureandsubstratestructureallhadremarkableeffectsonthereaction.(R)-oxynitrilasefromalmondaccommodatesawidevarietyofaromatic,heterocyclicandaliphaticaldehydes.Benzaldehydewasfoundtobethebestsubstrateforthe(R)-oxynitrilasefromalmond.Atlowtemperature0～5℃,bothconversionrateandenantiomericexcessoftheproductwereabove99%.Keywords　micro-aqueousphase,(R)-oxynitrilase,asymmetricsynthesis,(R)-cyanohydrins

　＊ThisworkwassupportedbyagrantfromNaturalScienceFoundationofGuangdong(980543).

＊　＊Correspondingauthor.Tel:86-20-87111452,E-mail:senlinliu@http://wendang.chazidian.com

　:,:August,