骨髓基质干细胞构建组织工程神经修复神经缺损的研究进展

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骨髓基质干细胞构建组织工程神经修复神经缺损的研究进展

景尚斐（综述），温树正‘（审校）

（内蒙古医学院第二附属医院手外二科，呼和浩特０１００３０）

中图分类号：Ｒ?３３２；Ｑ８１３

文献标识码：Ａ

文章编号：ｌ００６－２０８４（２００８）２３－３５６８司２

摘要：骨髓基质干细胞（ＢＭｓｃＢ）存在于骨髓和其他一些组织（如脂肪等），它不仅具有干细胞的基本特征，而且具有自我更新和多向分化的潜能，它分离、培养的成功，以及向神经细胞分化的成功，为修复周围神经损伤提供了一种新的组织工程学种子细胞来源。本文就ＢＭｓＣｓ作为种子细胞构建组织工程神经过程中的机制和所面临的新挑战进行综述，以探讨一种更新更有价值的周围神经缺损修复思路。

关键词：骨髓基质干细胞；组织工程；神经缺损；许旺细胞

导方法所表达的神经元和神经

胶质细胞表型存在差异，且神

经转化率、细胞病死率和存活时间也存在差异。

体外培养的ＢＭｓＣｓ具有

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贴壁生长特性，原代培养时细胞形态表现为圆形，大小不一，随着培养时间的延长，细胞出现突起，经传代后细胞形态似梭形或成纤维细胞样，呈集落或旋涡形生长。流式细胞仪检测结果表明，体外培养

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周围神经组织工程就是用组织工程学的原理，构建能完全替代自体神经移植修复周围神经缺损的

的细胞大多数处于Ｇ。／Ｇ，期旧Ｊ，电镜观察可见：细胞呈长梭形，胞核大而呈卵圆形，位于胞体中央，为常染色质，核仁明显。细胞内存在许多发育良好、结构正常的细胞器如线粒体、内质网、高尔基体和大量的

万方数据移植物。具体地说，就是将组织工程红学研究的三

要素：种子细胞、生物材料、仿生结构相结合，构建一种理想的周围神经修复材料…。随着细胞技术研究的进一步深入，骨髓基质干细胞（ｂｏｎｅｍａⅡ槲８ｔｒｏｍａｌｃｅＵｓ，ＢＭＳＣｓ）、许旺细胞（ｓｃｈｗ卸ｎｃｅｌｌ，ＳＣｓ）的培养已趋于成熟。已证实，ＢＭｓｃｓ经过诱导分化可以转化成ｓｃｓ，一些学者将ＢＭｓＣｓ与去细胞神经复合修复神经缺损，其在形态学和功能学上取得了较满意效果心１；因此，将ＢＭｓｃｓ作为种子细胞复合在三维仿生性、组织相容性好的神经替代支架材料中，渴望成为组织工程化人工神经修复神经缺损的全新思路。

ｌ

游离核糖体，胞质内有大量的内质网池、空泡和溶酶

体，扩张的内质网池内可见类脂类物质。细胞外周存在许多细小纤维束，大量胶原纤维从细胞伸出，构成了一个精细的网状纤维网络ＨＪ，ＢＭｓＣｓ易与造血系细胞区分，但其缺乏特异性的表面或胞质内抗原，目前鉴别主要依赖其形态学及功能学表现垆Ｊ。骨髓基质细胞目前尚无明确的表型分类，ＢＭＳＣｓ亦无高度特异的表面抗原。目前研究表明，ＢＭＳＣｓ的表面表达ＳＨ２、

ｓＨ３、ｃＤ约、ｃ乩、ＣＤ７Ｉ、ｃＤ９、ｃＤＩ嘣、ｃＤＩ加ａ、ＣＤｌ２４等，而

不表达ＣＤ＂ＣＤ３ｌ、ＣＤ弘、ＣＤ４５等细胞表面抗原旧’“。

２

ＢＭＳＣｓ的分离、培养及特性

ＢＭｓｃｓ分离方法主要有３种：贴壁分离筛选法、

ＢＭＳＣｓ向神经细胞分化的潜能

Ｂｕｒｋｈａｒｄ等＂ｏ和Ｙｏｓ｝ｌｉｉ等归１分别在体外成功地

密度梯度离心法及磁体分离法。到目前为止，细胞的黏附特性仍是分离和纯化ＢＭｓｃｓ的最基本原则，也是获取大量干细胞的一种常用方法。低糖型的ＤＭＥＭ或ｄ－ＭＥＭ培养基加ｌＯ％的胎牛血清也是目前ＢＭｓｃｓ的常规基础培养基，分低糖条件下比高糖条件下更利于ＢＭｓｃｓ的增殖；培养基还可以根据试验目的而添加一些成构成所谓的化学限定性培养基，如碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及胰岛素等成分以促进细胞的生长、增殖及分化，但诱导ＢＭｓＣｓ神经化的方法和技术还不成熟，不同的诱

基金项目：内蒙古医学院２００６年重大课题（ＮＹ２００６ｚＤ０１０）。通讯作者

诱导成年大鼠和人的ＢＭＳＣｓ分化为幼稚的神经元和胶质细胞，证明了大鼠ＢＭｓＣｓ在体外和体内可诱导分化为ｓｃｓ并具有一定的功能，可能作为神经修复种子细胞的新来源。在研究ＢＭｓＣｓ多向分化潜能的过程中，Ｃｕｅｖ鹪等¨则将分离纯化的ＢＭＳＣｓ注人人造坐骨神经缺损处，术后神经功能恢复较理想。移植部位Ｂｒｄｕ示踪显示有少量植入细胞表达ＳＣｓ相对的标志物Ｓ—１００蛋白，发现部分ＢＭｓｃｓ转化为Ｓｃｓ，而且通过神经断端的再生轴突具有明显的增多。Ｍｉｍｕｍ等【ｌ¨在体外环境下诱导ＢＭＳＣｓ向ＳＣｓ分化，并最终得到ＢＭｓｃｓ来源的ｓｃｓ，ｃｈｅｎ等¨引将ＢＭｓｃｓ移植到坐骨神经缺损的模型大鼠体内，术后观察到

有郎飞结、轴突及髓鞘重建；电生理检查显示ＢＭｓｃｓ

移植组大鼠运动神经传导速度及坐骨神经功能均明显优于对照组，提示ＢＭｓｃｓ可能作为神经修复种子细胞的新来源。应用ＢＭｓｃｓ修复周围神经损伤开展时间较短，但也取得了一些成果。ＢＭｓｃｓ作为供体细胞具有胚胎干细胞和神经干细胞所无法比拟的优点，易于自体内获得，体外培养有较强自我复制能力和多向分化潜能，故将其定向分化为神经元，并在体外大量扩增，对神经系统疾病的治疗具有深远的意义。尚剑等¨纠以ＤＭＥＭ为培养基体外诱导人ＢＭｓＣｓ分化为Ｓｃｓ，与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经，建立的坐骨神经缺损的大鼠动物模型表明：ＢＭｓｃｓ在体外可诱导分化为Ｓｃｓ，利用其与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经可以修复周围神经缺损。

３

ＢＭＳＣｓ对神经修复的促进作用

ＢＭｓｃｓ不仅能多向分化，而且还能合成细胞外

基质及分泌多种细胞因子，这些神经营养和保护因子可通过不同机制促进神经组织的修复和功能重建。Ｌｕ等¨４１利用ＢＭＳＣｓ移植治疗创伤性脑损伤模型大鼠，发现大鼠的神经功能得到明显改善，且万方数据ＢＭｓＣｓ移植大鼠脑组织内脑源性神经营养因子和神经生长因子含量均明显增加，起到神经保护、减少神经细胞凋亡及促进神经组织再生等作用。现阶段将神经营养因子应用于组织工程尚待解决的关键问题是维持其缓慢释放以达到在较长的神经再生期间促进轴突延伸和突触形成。

综合目前的相关研究结果，ＢＭｓｃｓ移植在组织修复领域的可能机制主要包括以下方面：首先，移植的ＢＭＳＣｓ能向损伤区域迁移并聚集，而且能够分化为损伤组织，因而ＢＭＳＣｓ能够替代因损伤而坏死、凋亡的神经元及神经胶质细胞，弥补损伤造成的神经功能缺损；其次，ＢＭｓＣｓ可以合成多种活性物质，这些神经营养和保护因子可通过不同机制发挥神经保护作用，减少神经细胞凋亡，同时还可能提供适宜的

为环境以促进神经组织修复与功能重建。神经缺损

后的再生，以轴突的延伸为主要特征，轴突与其相应的靶组织形成特定的连接是神经功能恢复的决定因子，目前神经组织工程的核心是具有良好组织相容性的神经支架与植入的种子细胞（ＢＭｓｃ￥）结合而成

的具有特定三维结构和生长活性的复合体，提供和保

证了神经再生修复所必需的细胞外基质和生长因子，支持引导轴突的再生Ｈ引，因此，ＢＭＳＣｓ在组织工程领域的研究应用被很多学者看为一新的研究热点。

７ｒｒｅｍａｉｎ等¨刮和ｗｏｏｄｂｕｒｙ等Ⅲｏ的研究指出，ＢＭｓＣｓ有“多分化的”基因表达谱，其可表达中胚层、

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内胚层、外胚层细胞系的基因特征，包括神经系特化的ｍＲＮＡ及神经营养因子，ＢＭＳＣｓ是具有神经干细胞样分化潜力的细胞。但定向诱导分化而来的神经干细胞以及由神经干细胞进一步分化成的神经元或胶质细胞，是否完全具有特定的功能¨刮？诱导的神经干细胞如何顺利进入丰串经组织和定向迁移，在体

内它们能否与宿主自体的神经细胞相容并存，能否

长期存活和增殖？还要在已有的基础上进一步从分子生物学和应用研究丽方殛进行研究，从而使种子细胞ＢＭＳＣｓ与去细胞神经复合构成的组织工程神经早日应用于临床，更好地修复神经缺损。参考文献

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骨髓基质干细胞构建组织工程神经修复神经缺损的研究进展

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英文刊名：

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1.期刊论文 孙晓宁.赵强.徐德民.陈安清.翟万银.史剑慧.虞勇.王克强.常江 骨髓基质干细胞-组织工程瓣膜的新细胞来源 -中国临床医学2004,11(2)

目的:比较人骨髓基质干细胞与人瓣膜间质细胞抗原表达和分泌基质的特点,探讨人骨髓基质干细胞用于构建组织工程瓣膜的可行性.方法:体外培养、扩增人骨髓基质干细胞和人瓣膜间质细胞,比较形态学和生长特性,免疫荧光和流式细胞仪检测比较两者的抗原表达,免疫组织化学检测两者的细胞外基质分泌.扫描电镜观察MSC在瓣膜支架上的附着.结果:骨髓基质干细胞具有肌成纤维细胞的形态,细胞型分析显示α平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性,平均荧光强度比分别为4.9和3.8,表达量与瓣膜间质细胞(2.4和3.1)接近.MSC分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白,组织学和扫描电镜可见骨髓基质干细胞在瓣膜表面生长旺盛,具有正常的分泌功能和形态.结论:骨髓基质干细胞易于从体内分离、扩增,具有和瓣膜间质细胞相似的形态、抗原表达和功能,可以在去细胞猪主动脉瓣膜附着和扩增,形成组织,显示MSC是一种有前途的细胞,可以作为瓣膜组织工程的种子细胞来源.

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目的探讨人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性.方法经1%Triton-X 100、0.01%胰酶-0.02%EDTA、DNase I及RNase I处理制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性;人骨髓基质干细胞体外分离、培养、扩增后种植在去细胞瓣叶表面,观察细胞生长情况.结果猪主动脉瓣叶去细胞后获得完整无细胞的纤维网状支架,瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率差异无统计学意义(P>0.05);体外培养的人骨髓基质干细胞(MSCs)在去细胞瓣叶表面形成一层基本连续的细胞层.结论去除细胞成分的猪主动脉瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的.

3.学位论文 孙晓宁 骨髓基质干细胞和去细胞猪瓣膜支架构建组织工程瓣膜的实验研究 2005

目的：探讨去垢剂和胰蛋白酶对于猪主动脉瓣膜去细胞过程的影响，研究组织工程心脏瓣膜生物支架的最佳制备方法。研究去细胞组织工程心脏瓣膜支架制作方法的改进及其生物学特性。比较人骨髓基质干细胞、人瓣膜间质细胞和脐带平滑肌细胞在抗原表达和分泌基质的特点，探讨人骨髓基质干细胞用于构建组织工程瓣膜的可行性。探讨应用猪去细胞瓣膜支架合骨髓基质干细胞体外构建组织工程瓣膜的可行性。探讨运用组织工程技术以骨髓基质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜在裸鼠体内的转归。

　　结论：曲拉通脱氧胆酸钠法可以有效去除细胞成分，对瓣膜结构影响较小，是一种有效去细胞的方法。猪去细胞瓣膜支架具有良好的生物学特性，适合作为组织工程的瓣膜支架。骨髓基质干细胞易于从体内分离、扩增，具有和瓣膜间质细胞相似的形态、抗原表达，骨髓基质干细胞可以作为瓣膜组织工程的种子细胞来源，值得进一步的研究。骨髓基质干细胞种植在采用曲拉通脱氧胆酸钠和核酸酶方法制作的去细胞瓣叶支架上，可在体外生成组织工程心脏瓣叶。二次沉淀法种植细胞可以增加种植细胞的数量。运用组织工程技术以骨髓基质干细胞和去细胞猪瓣膜可在体外生成初级组织工程瓣膜，植入裸鼠体内可见骨髓基质干细胞生长，无向成骨细胞分化。

4.期刊论文 王有刚.李新庆.李春和.吴智远.崔磊.刘广鹏.李宇琳.孙剑.WANG Yougang.LI Xinqing.LI Chunhe.WUZhiyuan.CUI Lei.LIU Guangpeng.LI Yulin.SUN Jian 自体骨髓基质干细胞组织工程骨修复颅骨缺损的临床研究 -组织工程与重建外科杂志2009,5(3)

目的 探讨人骨髓基质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损的可行性.方法 自2006年6月至2007年2月,共4例外伤后颅骨缺损患者,抽取患者骨髓,分离得到hBMSCs,体外扩增和成骨诱导后,将hBMSCs与部分脱钙骨复合,体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区.分别于术后1周和3个月、6个月进行临床和三维CT检查随访.结果 术后1周,三维CT均显示骨缺损区被所植入的组织工程骨充填;术后3～6个月,CT显示组织工程骨形成并修复骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合.高龄患者及骨缺损面积过大患者,组织工程骨体内成活率较差.结论 通过选择适宜的病例,以自体hBMSCs作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程骨并可用于修复颅骨缺损.

5.期刊论文 杨新明.石蔚.杜雅坤.黄艳平.孟宪勇.邹宇纬.阴彦林.李化光 浓集自体骨髓基质干细胞组织工程复合物治疗早期股骨头坏死的实验疗效 -生物骨科材料与临床研究2008,5(3)

目的 研究浓集自体骨髓基质干细胞组织工程复合物治疗兔早期股骨头坏死的实验疗效,为临床应用提供依据.方法 24只新西兰大白兔随机分为两组.建立右侧股骨头骨缺损模型,并用液氮从缺损内将股骨头冷冻坏死,A组为对照组,仅植入空白明胶海绵,B组为实验组,植入复合物.术后每组分别于2、4、6、8周各处死3只动物,做影像学及组织学检查.进行有关指标检测.结果 ①影像学结果:随着时间延长无论是X线、CT表现还是MRI表现,实验组钻孔区由低密度逐渐增高,8周时有骨小梁结构;对照组钻孔区无新骨形成表现.②组织学结果:A组2周标本缺损区内,充满坏死的组织碎片;4周标本,缺损区内为疏松的纤维肉芽组织;6周标本缺损区内为纤维组织;8周标本缺损区内仍为纤维组织,无新生骨组织.B组2周标本缺损区内,有大量的成骨细胞;4周标本,缺损区内有大量骨小梁及类骨质填允;6周标本缺损区内出现比较成熟的骨小梁;8周标本缺损区内骨小梁成熟,骨髓组织形成.结论 浓集白体骨髓基质干细胞组织工程复合物对兔股骨头坏死有极好的修复作用.

6.学位论文 蔡松旺 骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的初步研究 2006

[背景]

组织工程心脏瓣膜是采用人工合成的材料，制成组织工程心脏瓣膜的支架，通过将体外扩增的自体活细胞种植在瓣膜支架上，细胞能够牢固黏附、生长，使其具有正常瓣膜组织的新陈代谢功能，最后应用于置换病变的瓣膜，在体发挥类似于正常瓣膜的功能。从理论上可以完全克服目前所用机械瓣膜和生物瓣膜的缺点，具有非常重要的临床运用前景。本试验探讨体外培养骨髓基质干细胞作为种子细胞，种植在有P4HB[聚β羟基丁酯]构建的心脏瓣膜上，旨在尝试为TEHV的研究提供合适的种子材料和瓣膜支架材料及增加种子材料与瓣膜支架材料黏附力的方法。

[方法]

1.取年轻健康狗髂前上嵴的骨髓，分离培养出骨髓基质干细胞，通过HE染色、Mallory染色、Masson染色及免疫组化鉴定为骨髓基质干细胞(MSC)，取第三代细胞种植在有P4HB构建的心脏瓣膜上，培养两周后，用扫描电镜观察.

2.取6个规格相同的有P4HB[聚β羟基丁酯]构建的心脏瓣膜，气体消毒后分别置入不敷12孔板中，每2个为1组，前两组分别被Fn及poly-lysine包被，第3组空白对照。24小时后分别种植骨髓基质干细胞0.8×105个，24小时后在瓣膜背面再分别种植0.25×105个。2周后分别行MTT检测及扫描电镜检测。取不同数量的MSC，行MTT检测，制作不同细胞个数与MTT吸收光度的曲线。

[结果]

1.培养的细胞经细胞染色及免疫组化染色鉴定均支持其为MSC。

2.扫描电镜下，未种植细胞的瓣膜呈蜂窝状，孔径在89μm～150μm之间，适宜MSC的爬行；种植细胞后，瓣膜表面有大量MSC黏附，且爬行长入蜂窝状空径内

3.经Fn及poly-lysine包被的MTT吸光度OD值均数分别为0.12896及0.12033，均明显高于对照组0.11254，有统计学意义；Fn组与poly-lysine组相比亦有显著差异，前者高于后者。

[结论]

MSC和以P4HB为材料的瓣膜支架构建TEHV具有可行性.。Fn能有效的促进细胞在生物可降解的组织工程心脏瓣膜的粘附及增殖，是发展组织工程心脏瓣膜的一种优良的细胞粘附剂。

7.期刊论文 刘春明.付国伟.文冰.舒礼良.赵文增 人骨髓基质干细胞构建组织工程心脏瓣膜的研究 -山东医药2008,48(13)

取心血管外科手术患者胸骨骨髓,Ficoll离心法获取单个核细胞,体外培养扩增后种植在猪去细胞主动脉瓣叶表面2周,观察细胞生长情况;免疫组化检测细胞分化结果;扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况.结果 经体外培养的入骨髓基质干细胞在去细胞猪主动脉瓣叶纤维网状支架表面形成一层基本连续的细胞层.认为去细胞猪主动脉瓣叶组织是良好的纤维支架,可用于构建组织工程心脏瓣膜;人骨髓基质干细胞种植在去细胞猪主动脉瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的.

8.期刊论文 杜俊鹏.张凯伦.傅平.Du Junpeng.Zhang Kailun.Fu Ping 人骨髓基质干细胞作为心血管瓣膜组织工程种子细胞的实验研究 -华中科技大学学报（医学版）2006,35(4)

目的 探讨人骨髓基质干细胞(human bone marrow stromal cells,hMSC)作为心脏瓣膜组织工程种子细胞的可行性.方法 取胸外科手术患者肋骨骨髓,Ficoll离心法获取单个核细胞,体外培养扩增,以流式细胞仪检测hMSC的表面抗原.将自然分化的hMSC接种于去细胞猪心瓣膜上2周,免疫组化检测细胞分化结果;扫描电镜和透射电镜观察细胞种植情况;生化检测种植细胞DNA含量和细胞外基质,并和隐静脉来源成纤维细胞构建的组织工程瓣膜作对比.结果hMSC在自然条件下能够分化表现成纤维细胞特性,Vimentin和α-SMA染色阳性;电镜观察活性成肌纤维细胞在瓣膜表面生长均匀平滑;瓣膜组织DNA和胶原含量显著高于去细胞瓣组,与成纤维细胞对照组无明显差异.结论 hMSC能够在自然条件下先向成纤维细胞分化,并在去细胞猪心瓣膜上增殖生长,分泌胶原,可作为心血管瓣膜组织工程的种子细胞.

9.学位论文 程永庆 人骨髓基质干细胞体外构建组织工程心脏瓣膜的实验研究 2004

目的:该实验的目的是将体外培养扩增的人骨髓MSCs种植在去细胞猪主动脉瓣叶上,观察细胞生长情况,以探讨人骨髓MSCs体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性.结论:1.采用1﹪ Triton-X 100、0.01﹪胰酶-0.02﹪EDTA、DNase I及RNase I去细胞方法,可以完全去除猪主动脉瓣叶的细胞,对其生物力学性能无明显影响.去除细胞成分的猪主动脉瓣组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程心脏瓣膜.2.骨髓MSCs在20﹪胎牛血清DMEM培养液培养下能分化成肌成纤维细胞.3.体外培养扩增的骨髓MSCs能在猪去细胞瓣叶上生长,显示较好的生物相容性,作为种子细胞构建组织工程心脏瓣膜是可行的.

10.期刊论文 杨新明.石蔚.杜雅坤.曾春萍.苏立军.李金.孟宪勇.杨峰 自体骨髓基质干细胞组织工程复合物治疗骨囊肿的疗效 -实用医学杂志2006,22(19)

目的:探讨自体骨髓基质干细胞(BMSCs)组织工程复合物治疗骨囊肿的临床疗效.方法:对18例骨囊肿患者以玻璃酸钠为载体抽取自体BMSCs加入甲基强的松龙,在X线透视下,将2根骨穿针经皮分别自囊腔顶部和底部刺入骨囊肿内,抽去囊液,冲洗囊腔后注入复合物.其中14例注射1次,4例注射2次间隔2～3个月.结果:本组病例随访时间10～18个月,平均14个月,骨愈合良好,无复发及并发症.根据Neer和Chrigira的X线评价骨囊肿愈合标准进行评估,本组18例治疗10个月后均达到Ⅳ级,平均治疗2～3个月后大部分病例囊腔出现硬化骨,密度增高,透光区开始模糊;3～4个月后囊腔大部分消失,残留小而模糊囊腔;5～6个月后囊腔进一步缩小,少数囊腔已消失;8～9个月后囊腔骨皮质变厚,骨小梁及部分髓腔开始贯通,绝大多数囊腔基本消失;10个月后骨囊腔完全愈合,治愈率100%.18例骨囊腔愈合时间3～10个月,平均5个月.结论:本方法治疗骨囊肿疗效确切、方法简单、不需手术、创伤最小、痛苦最轻、无并发症、费用较低、患儿及家长易于接受,是目前安全有效、治愈率最高、便于基层医院推广使用的一种最新型治疗方法.

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下载时间：2010年9月21日