第八章 蛋白质的测定Word

　　第八章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 1. 蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。 主要由 C 、 H 、 O 、 N 、 S 五种元素组成。某 些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。

　　食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要 (也是最常用的)用凯氏定氮法测定总氮量，然 后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的 氮，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮 类脂、卟啉和含氮的色素所以只能称为粗蛋白的 含量(但马铃薯等非蛋白氮多的要单测)。蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总 热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质， 只是含量及类型不同。

　　关于氮-pro换算等数 对于氮含量换算成pro含量的等数，历来采用 6.25,这个数值是以pro平均含氮而导出的数值， 但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差 别是很大的，我们在测定pro时，应该是不同 的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出 了一部分换称等数，用时可查，蛋=6.25,肉 =6.25,牛乳=6.38,稻米=5.95,大麦=5.83,玉 米=6.25,小麦=5.83,麸皮=6.31,面粉=5.70, 如果手册上查不到的样品则可用6.25,一般在 写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。

　　蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折 射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和 碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法： 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪

　　氨基酸总量——酸碱滴定法测定。

　　各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。

　　第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合 并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 (一)糖蛋白的显色(3种方法) (二)脂蛋白的显色(2种方法)

　　一些蛋白质的含氮量 一般为 15%~ 17.6%,有的上下浮动 可以测出总氮 N

　　N = N6.25 = 蛋白质含量 16%

　　一、 凯氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、 微量、

　　自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。 书中只介绍前三种。

　　加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂(做蒸馏时碱性指示剂)。还可以加氧 化汞、汞(均有毒，价格贵)、硒粉、二氧化 钛。

　　加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。

　　仪器：要防止 爆沸。 另外：介绍 “自动回流消 化仪”

　　(3) 吸收与滴定 用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂(甲基红—溴甲基酚绿混合指 示剂)国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 绿色 红色 滴定 吸收 (酸) (碱) (酸) 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再 用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红 指示剂。

　　3、说明： ① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾， 以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物 在无硫酸存在的情况下消化不完全而造 成氮损失。

　　③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷 凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消 化完全。④ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易 产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始 消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入 少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注 意控制热源强度。

　　⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30%过氧化氢 2—3 m1 后再继续 加热消化。

　　⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试 样5 m1的比例增加硫酸用量。

　　⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品.如 含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等 时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全， 消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深 绿色。⑧ 蒸馏装置不能漏气。

　　⑨ 蒸馏前若加碱量不足

　　,消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

　　氢氧化铜在70~90℃时发黑。⑩ 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清 洗管口，再蒸1分钟后关掉热源.否则可能造成 吸收液倒吸。

　　二、 微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置见下图 。 10 ml, 0.01 mol/L , 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L

　　北京福德泰和科技有限公司

　　产品名称： 凯氏定氮仪

　　二、双缩脲法传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准 确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。

　　1. 原理 脲(尿素)NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时， 两分子缩和成双缩脲。NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这 种反应叫双缩脲反应。(缩二脲反应) 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下， 其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计 来测其吸光度，确定含量。(560nm)

　　注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。 样品不用消化

　　2. 方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学 领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于 豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3.主要仪器： 分光光度计，离心机( 4000 r/min) 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳

　　5.操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为 标准样绘标准曲线。

　　三.紫外吸收法 1.原理：利用蛋白质的特有基团， R │ (— NH—CH—CO) 对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白 质浓度成直线关系，求含量。

　　2.适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因 素多，故在食品分析领域应用不广泛。

　　3.主要仪器：① 紫外分光光度计

　　②

　　离心机(3000 — 5000 r/min)

　　4.操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线

　　第五节

　　氨基酸的定性测定

　　利用各种显色反应

　　第六节

　　氨基酸定量测定

　　一.氨基酸的一般定量测定 (一)甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身有碱性 —NH2— 基，又有 酸性 —COOH 基，成中

　　性内盐，加入甲醛 溶液后，与 —NH2— 结合，碱性消失，再 用强碱来滴定 —COOH 基。

　　2.特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其 发酵过程中氮量减少情况等。(适于食品 中游离氨基酸的测定)

　　3.双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液， ③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4.操作：同时取两份样： ① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。 ② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。 二者之差可计算氨基酸含量

　　(二)茚三酮的比色法

　　原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应， 生成蓝紫色化合物，可比色定量。颜色深浅与氨 基酸含量成正比，最大吸收波长为570nm. (三)电位滴定法

　　(一)原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层

　　板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等 作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不

　　同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，

　　鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。

　　Rf = a /

　　b溶剂前沿 b 样点 a

　　点样原点

　　(三)操作方法： ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔1~2cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф 3 mm 滤纸

　　片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。

　　⑤ 显色： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 (涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中)

　　第八章 重点1.为什么说用凯氏定氮法测出的蛋白质只能称作粗蛋白？

　　2.凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理？步骤和注意事项。3.消化时加入K2SO4和 CuSO4的作用是什么？ 4.蛋白质的结果计算为什么要乘上蛋白质换算系数？6.25的 系数是怎么得到的？ 5.蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要调成酸性？ 6.双缩脲法测定蛋白质的原理。 7.氨基酸总量的测定方法(甲醛滴定法)。 8.简述茚三酮比色法测定蛋白质的原理。