现代分子生物学

现代分子生物学作业

生物医学工程1202班

林可慧

研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：

一、DNase 1 足迹实验

二、甲基化干扰实验

三、凝胶阻滞实验

四、体内足迹实验

五、拉下实验

一、DNase 1足迹实验

1、概念:

足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。

2、原理：

当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用，而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为“足迹”。

3过程：

(1).将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记，并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端，于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA

(2).在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白质复合体

(3).在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链，只发生一次磷酸二酯键的断裂：

a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质，使DNase I消化之后，便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；

b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合，被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；

(4).除去蛋白，加样在20%序列胶上进行电泳分离，实验分两组:

a、实验组：DNA+蛋白质混合物

b、对照组：只有DNA，未与蛋白质提取物进行温育

(5).最后进行放射性自显影，分析实验结果。

4、结果判断:

实验组凝胶电泳显示的序列，出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较，便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列。

5、其他的足迹实验方法：

除了DNase1足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如： a、 自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验

DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理

DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割。如果DNA分子中某一区段同转录因子结合，就可以避免发生G

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残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用。

6、优缺点：

a.优点：可以形象的展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过使用足迹实验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同的蛋白质因子之间的结合位点的分布情况。也可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此可以确定其核苷酸序列的特异性。

b.缺点：蛋白质浓度高时才有效，需要蛋白质纯化的操作。而且DNase 1活性所需的氯化镁和氯化钙会破坏特异性的相互作用。

二、甲基化干扰实验

1、概念：

甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。

应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。

2、实验步骤：

(1).用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）

(2).同细胞蛋白质提取物一起进行温育，促进使DNA与蛋白质的结合

(3).进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：

a、其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带

b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带

(4).将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出，并用六氢吡啶进行切割，结果为： a、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合，所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后，转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用，从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；

b、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割

（5）将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带，经六氢吡啶切割作用之后，再进行凝胶电泳

(6).作放射自显影，读片并分析结果

3、结果判断：

a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割之后，电泳分离呈现两条带，有一个空白区

b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列，经六氢吡啶切割后，电泳分离呈现三条带，没有空白区域的出现。

4、应用：

a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系； b、是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置

5、优缺点：

a.DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。

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b.可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。

三、凝胶阻滞实验

1、概念：

凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

2、原理：

在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。

3、过程:

a.首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）

b.用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）

c.这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物

d.在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 e.最后进行放射自显影，分析电泳结果

4、实验结果的分析：

a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；

b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。

5、优点：

a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；

b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；

c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；

d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。

四、体内足迹实验

上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验，因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。

为了解答这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。

1、原理：

体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别，即

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a、DMS能够使G残基甲基化；

b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基；

c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割；

d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。

2、过程：

a.用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化

b.对这些经过DMS处理的细胞提取DNA，并在体外加入六氢吡啶作消化反应

c.PCR扩增后作凝胶电泳分析，因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够，而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA，其数量是微不足道的，所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA

d.放射自显影，读片并记录读片的结果

3、结果判断：

a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；

b、体外裸露的DNA分子上，G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割。

4、优缺点：

与应用克隆DNA片段所作的体外足迹实验的结果相比，经体内足迹实验从染色质总DNA中所获得的任何一种特异DNA的数量都是微不足道的。因此，有必要通过PCR扩增特异的靶DNA，以获得足够数量的DNA样品。如今体内足迹实验已发展成为研究在完整的活细胞内，DNA和蛋白质结合微电机检测结合位点中碱基突变效应的一种极为有效的手段。

五、拉下实验（Pull-down assay）

拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组，表达为融合蛋白。分离纯化融合蛋白并与磁珠结合，使之固相化之后，再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间，例如在4℃下保温过夜，使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合。离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白，经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来，收集样品，再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析，以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白。