罗汉果葡萄糖基转移酶基因SgUGT4的克隆及表达研究

园艺学报，2015，42 (3)：523–534.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0757；http：//www. ahs. ac. cn 523 罗汉果葡萄糖基转移酶基因SgUGT4的克隆及表达研究

莫长明1,2，马小军3,*，唐 其4,*，白隆华2，潘丽梅2，冯世鑫2

23（1广西大学农学院，南宁 530004；广西药用植物园，南宁 530023；中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193；

4湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128）

摘 要：以授粉后70 d的罗汉果为材料，采用RT-PCR和RACE技术克隆到一个葡萄糖基转移酶基

因，命名为SgUGT4。该基因cDNA全长1 726 bp，包含完整的开放阅读框1 344 bp，编码447个氨基酸。

构建pET32a-SgUGT4原核表达载体，转化大肠杆菌Rossetta-gami（DE3），经IPTG诱导获得分子量约65

kD的目的基因融合蛋白。系统进化分析表明，SgUGT4与具有罗汉果苷合成活性的拟南芥和甜叶菊葡萄

糖基转移酶AtUGT73C3、AtUGT73C5、AtUGT73C6、SrUGT73E1聚在一个亚家族。实时荧光定量PCR

检测表明，SgUGT4在罗汉果甜苷Ⅴ主要积累部位果肉的表达量高于茎、叶、花和果皮，在根和种子中几

乎不表达；果实发育40 ~ 50 d，甜苷Ⅴ开始积累，SgUGT4表达量则逐渐升高，50 d时急剧上升；甜苷Ⅴ

含量越高的品种，SgUGT4表达量也越高。SgUGT4可能在罗汉果甜苷Ⅴ生物合成过程中发挥作用。

关键词：罗汉果；葡萄糖基转移酶；基因克隆；原核表达；时空表达

中图分类号：S 576 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0523-12

Cloning and Expression Patterns of SgUGT4 Gene from Siraitia grosvenorii MO Chang-ming1,2，MA Xiao-jun3,*，TANG Qi4,*，BAI Long-hua2，PAN Li-mei2，and FENG Shi-xin2 （1Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530004，China；2Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant，

3Nanning 530023，China；Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，

4China；College of Horticulture and Landscape Architecture，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

Abstract：A glucosyltransferase gene，named as SgUGT4，was cloned from Siraitia grosvenorii fruits at 70 days after pollinating（DAP）by RT-PCR and RACE methods. The full-length cDNA of SgUGT4 is 1 726 bp and has an open reading frame（ORF）of 1 344 bp which encodes a predict protein of 447 amino acids. The recombinant plasmid pET32a-SgUGT4 was constructed in a prokaryotic expression system and then was transformed into E.coli strain Rossetta-gami（DE3），a 65 kD fusion protein was expressed after being induced by IPTG. Phylogenetic tree analysis showed that SgUGT4 was classified as the same subfamily as the glucosyltransferase of AtUGT73C3，AtUGT73C5，AtUGT73C6 from Arabidopsis thaliana and SrUGT73E1 from Stevia rebaudiana，which could catalyze mogrosides biosynthesis. 收稿日期：2014–11–03；修回日期：2015–01–12

基金项目：国家自然科学基金项目（30860379，31400275）；国家科技支撑计划项目（2011BA101B03）；广西自然科学基金项目 （2013GXNFSBA019170）；广西卫生厅中医药科技专项（GZPT1235）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xjma@http://wendang.chazidian.com；tangqi423@http://wendang.chazidian.com）

Mo Chang-ming，Ma Xiao-jun，Tang Qi，Bai Long-hua，Pan Li-mei，Feng Shi-xin.

Cloning and expression patterns of SgUGT4 gene from Siraitia grosvenorii.

524 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：523–534. qRT-PCR analysis demonstrated that the expression level of SgUGT4 in pulps where mogroside Ⅴ most abundantly accumulated was more higher than that in stems，leaves，flowers and peels. SgUGT4 did not nearly expressed in roots and seeds. From 40 DAP to 50 DAP，the content of mogrosideⅤgradually occurred and accumulated，the expression level of SgUGT4 rose gradually. The expression level of SgUGT4 up-regulated sharply after 50 DAP. The more higher the mogroside Ⅴ content in varieties was，the more higher its expression level of SgUGT4 in varieties was. Therefore，the SgUGT4 probably involved in mogroside Ⅴ biosynthesis.

Key words：Siraitia grosvenorii；glucosyltransferase；gene cloning；prokaryotic expression；temporal and spatial expression

罗汉果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey]为葫芦科罗汉果属多年生藤本植物，作为药材和甜味剂使用已有数百年历史，其主要活性和甜味成分为甜苷Ⅴ（mogrosides Ⅴ）。甜苷Ⅴ具有镇咳平喘、润肠通便、降血糖、抗氧化和增强免疫力等功效（Suzuki et al.，2005；陈维军 等，2006；戚向阳 等，2006；国家药典委员会，2010），其甜度是蔗糖的300 ~ 400倍，且热量低，是糖尿病人食糖的理想替代品，因而在天然药物和甜味剂开发方面受到广泛关注。然而，甜苷Ⅴ在罗汉果中含量不高，仅占鲜果质量的0.2% ~ 0.4%，使得其生产与应用成本较高。一方面，甜苷Ⅴ提取收得率已较高，改进提取工艺降低其生产与应用成本的潜力有限；另一方面，受种质资源匮乏和雄株严重浪

，杂交育费土地的影响（杂交后代中雌雄比例约3︰7，苗期无法鉴定性别，单株占地面积4 ~ 5 m2）

种提高果实甜苷Ⅴ含量的难度大。因此，克隆罗汉果甜苷Ⅴ生物合成关键酶基因，通过基因工程技术发酵合成甜苷Ⅴ或培育高甜苷Ⅴ品种，成为解决其高成本问题的新途径。

苏小建等（2007，2008）研究发现，罗汉果根、茎、叶、果皮和种子中几乎不含甜苷Ⅴ，甜苷Ⅴ主要存在于果肉中。果实皂苷积累动态研究表明，果实发育前40 d，果实中主要含苷Ⅱ和苷Ⅲ，不含甜苷Ⅴ；40 ~ 50 d的果实中苷Ⅱ和苷Ⅲ逐渐减少，甜苷Ⅴ开始积累；50 ~ 70 d果实甜苷Ⅴ快速积累，苷Ⅱ和苷Ⅲ则减少消失；70 d后果实主要含甜苷Ⅴ，不含苷Ⅱ和苷Ⅲ（刘金磊 等，2007）。研究认为，甜苷Ⅴ是先由细胞色素P450氧化葫芦二烯醇产生罗汉果醇，再由葡萄糖基转移酶对罗汉果醇进行糖基化修饰，逐渐从低糖苷到高糖苷转化而成（Tang et al.，2011），其直接前体物质可能为苷Ⅱ或苷Ⅲ（莫长明 等，2014）。Liu等（2013）以罗汉果醇为底物，对250个不同植物的葡萄糖基转移酶基因进行重组蛋白体外筛选试验，鉴定出拟南芥葡萄糖基转移酶AtUGT73C3、AtUGT73C5、AtUGT73C6和甜叶菊葡萄糖基转移酶SrUGT85C2、SrUGT73E1，能以尿苷–5’–磷酸葡萄糖作为糖基供体，在C3-OH、C24-OH或C25-OH位置上催化罗汉果醇产生罗汉果皂苷MogrosideⅠa、MogrosideⅠb或MogrosideⅠ。邢爱佳等（2013）利用RT-PCR和RACE技术，克隆出首个罗汉果葡萄糖基转移酶基因SgUDPG1，通过原核表达成功获得该基因可溶性重组蛋白。但是，罗汉果苷Ⅰ与苷Ⅱ、苷Ⅲ间的关系如何，苷Ⅱ或苷Ⅲ如何转化成甜苷Ⅴ，这一转化过程需要多少个葡萄糖基转移酶参与等问题仍不清楚。

本研究中根据罗汉果转录组与表达谱分析筛选出的候选葡萄糖基转移酶基因Unigene序列进行甜苷V生物合成相关葡萄糖基转移酶基因RACE克隆，生物信息学分析，重组蛋白原核表达，不同组织、不同发育期果实和不同甜苷含量品种中表达水平比较研究，为进一步通过体外试验研究所克隆基因的生化特性奠定基础，也为转基因发酵合成甜苷Ⅴ或培育高甜苷Ⅴ品种提供基因资源。

莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.

罗汉果葡萄糖基转移酶基因SgUGT4的克隆及表达研究.

园艺学报，2015，42 (3)：523–534. 525 1 材料与方法

1.1 材料

采集‘农院B6’、‘永青1号’和‘野红1号’罗汉果授粉后10、20、30、40、50、60、70和90 d果实果肉，以及‘农院B6’品种授粉后50 d的根、茎、叶和花，液氮速冻后–80 ℃冰箱保存备用。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因克隆及序列分析

采用Trizol法（Tang et al.，2011）提取‘农院B6’授粉后70 d果实果肉的总RNA，根据前期获取的SgUGT4（Siraitia grosvenorii uridine diphosphate glucosyltransferase gene 4）Unigene38974序列，设计5′-RACE特异引物（CGCCGACGGAGATTCCTTCCAGAACAGA）和3′-RACE特异引物（AATAGGCGTTAAGTCAGGGAAGGGAG），按照Clontech公司SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行PCR扩增，参照Axygen凝胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送华大基因公司进行测序。

采用BioXM进行开放阅读框（open reading frame，ORF）编码氨基酸序列翻译。NCBI网站上进行氨基酸序列同源性Blastp比对。采用DNAMAN进行氨基酸序列多序列比对，并用MEGA5.1构建系统进化树。ProtParam在线预测基因编码蛋白一级结构。ProtScale在线分析基因编码蛋白亲疏水性。InterProScan、Scratch Protein Predictor、MHMM、SinglP4.1和WOLF PSORT在线预测基因编码蛋白保守结构域、二硫键、跨膜区、信号肽和亚细胞定位。用Phyre2在线进行基因编码蛋白三级结构的同源建模。

1.2.2 原核表达载体构建及酶切鉴定

根据SgUGT4的ORF设计5′-PCR引物AGTGGTACCATGGTGGTTTCCACTTCCAGCGG（划线部分为KpnⅠ酶切位点）和3′-PCR引物ACTGAATTCTTATCTGATTAAATTAGTTGATTTT（划线部分为EcoRⅠ酶切位点）。以授粉后70 d的果实果肉cDNA为模板，PCR扩增SgUGT4完整ORF。反应体系：cDNA模板2 µL、上下游引物各1 µL、5 × Prime Star Buffer（Mg2+）10 µL、dNTP Mix 4 µL、Prime Star Taq酶0.5 µL、ddH2O 31.5 µL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃ 10 min。对PCR产物进行克隆、转化。筛选阳性克隆为模板，PCR扩增获取SgUGT4完整ORF，酶切后定向连接到原核表达载体pET32a的KpnⅠ和EcoRⅠ位点上，构建重组质粒PET32a-SgUGT4。酶切鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rossetta-gami（DE3）。

1.2.3 融合蛋白诱导及SDS-PAGE分析

34 µg · mL-1 接种带PET32a-SgUGT4质粒大肠杆菌于5 mL的LB培养基（30 µg · mL-1卡那霉素，

，37 ℃培养至OD600值0.6左右，添加IPTG（0.2 mmol · L-1）诱氯霉素，34 µg · mL-1氨苄青霉素）

导蛋白表达。分别于15 ℃过夜、22 ℃过夜、30 ℃过夜、37 ℃ 5 h条件下诱导后，4 ℃、5 000 ×g离心5 min收集菌体。菌体加PBS重悬后，冰浴中超声波破碎至澄清。上清和沉淀处理后分别进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色（BSP041）。

1.2.4 融合蛋白Western blot分析

诱导融合蛋白SDS-PAGE电泳后，于转印缓冲液（0.025 mol · L-1 Tris base，0.192 mol · L-1甘氨酸，30%甲醇）中，采用夹心法电转印至PVDF膜上（300 mA转印80 min）；PVDF膜放入封闭液

Mo Chang-ming，Ma Xiao-jun，Tang Qi，Bai Long-hua，Pan Li-mei，Feng Shi-xin.

Cloning and expression patterns of SgUGT4 gene from Siraitia grosvenorii.

526 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：523–534. （1× TBST，3%脱脂奶粉）室温封闭1 h；封闭好的膜与一抗（生工AB10002）4 ℃孵育过夜；一抗孵育后，1× TBST洗涤膜3次，每次5 min；洗净的膜与二抗（生工AB10058）室温下孵育1 h；二抗孵育后，1× TBST洗涤膜3次，每次5 min；TMB显色（生工 PW025）观测结果。

1.2.5 融合蛋白纯化及检测

15 ℃诱导过夜，收集4 L菌体，超声破碎菌体收集上清液。上清液经Ni-IDA-SefinoseTM Resin

50 mmol · L-1 Tris（生工BSP030-2）亲和层析纯化。500 mmol · L-1咪唑洗脱液放置到2 mol · L-1尿素、

溶液（pH 8.0）中透析过夜。透析后蛋白再进行Q SefinoseTM FF（生工SF007-Q）阴离子交换层析纯化。洗脱液透析到50 mmol · L-1 Tris、500 mmol · L-1 NaCl、2 mmol · L-1 DTT溶液（pH 8.0）中。透析后蛋白用PEG20000（生工PT1790-250 g）浓缩，过滤分装，–80 ℃保存。纯化蛋白通过SDS-PAGE电泳检测，ChemiDocTM XRS+ system灰度分析估算纯度。

1.2.6 目的基因时空表达规律分析

按刘金磊等（2007）HPLC法测定‘农院B6’、‘永青1号’和‘野红1号’品种授粉后10、20、30、40、50、70和90 d果实果肉中甜苷Ⅴ含量。

提取样品总RNA，利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法检测SgUGT4在‘农院B6’品种授粉后10、20、30、40、50和60 d果实果肉和根、茎、叶、花、果皮、种子中的表达差异，以及在‘农院B6’、‘永青1号’和‘野红1号’品种授粉后50 d果实果肉中的表达差异。反应体系：2 × SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 µL、50 × ROX Reference DyeⅡ 0.5 µL、正反向引物各0.5 µL、cDNA模板1 µL，加水补足至25 µL，每个反应重复3次。qRT-PCR扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。qRT-PCR均以UBQ5基因为内参基因。

2 结果与分析

2.1 目的基因克隆及序列分析

通过RACE克隆，获得3′-RACE片段497 bp，5′-RACE片段1 125 bp（图1），经测序拼接后，获得SgUGT4的全长1 726 bp。

SgUGT4的5′端包含1个111 bp非编码区，3′端包含1个243 bp非编码区和28 bp明显的poly

（A）结构，ORF位于112 ~ 1 455 bp位点，共计1 344 bp，编码一个447 aa的肽链（图2）。

图1 SgUGT4的3′-RACE和5′-RACE扩增

Fig. 1 Amplification of the SgUGT4 gene 3′-RACE and 5′-RACE

莫长明，马小军，唐 其，白隆华，潘丽梅，冯世鑫.

罗汉果葡萄糖基转移酶基因SgUGT4的克隆及表达研究.

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图2 SgUGT4基因ORF编码氨基酸序列

Fig. 2 Amino acid sequence of the SgUGT4 gene open reading frame

ProtParam分析表明，SgUGT4蛋白肽链由20种氨基酸组成，分子式C2232H3545N607O649S24，理论分子量为50.04 kD，等电点pI为5.80，其中Leu（12.1%）、Glu（8.7%）和Gly（8.1%）含量较高，Tyr（1.3%）、His（2.2%）和Trp（2.2%）含量较低，Cys、Pro分别为11个（2.5%）和22个（4.9%），总疏水性指数–0.143。Scratch Protein Predictor和ProtScale分析预测，SgUGT4蛋白共形成4个二硫键，分别在85位和124位，210位和217位，155位和159位、337位和363位连接；存在6个疏水区和8个亲水区，其中18 ~ 40位点，244 ~ 284位点，316 ~ 368位点疏水性较强。MHMM和SinglP4.1分析显示，SgUGT4蛋白不存在跨膜区和信号肽。WOLF PSORT预测SgUGT4蛋白的亚细胞定位情况为：叶绿体的定位系数为11.0（chlo：11.0），细胞核的定位系数为2.0（nucl：2.0）。

InterProScan分析发现，SgUGT4蛋白含有UDP–葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶结构域（IPR002213：UDP-glucuronosyl/UDP-glucosyltransferase）和一些在IPR中尚未明确分类的结构域。UDP–葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶结构域包括，位于1 ~ 447 bp的UDP–葡萄糖醛酸/葡萄糖基转移酶结构域（PTHR11926，GLUCOSYL/GLUCURONOSYL TRANSFERASES）、位于246 ~ 400 bp的UDP–葡萄糖基转移酶结构域（PF00201，UDPGT）和位于318 ~ 361 bp的UDP–葡萄糖基转移酶结构域（PS00375，UDPGT）。其中，318 ~ 361 bp位保守结构域（PS00375）为植物次生代谢产物葡萄糖基转移酶特有保守结构域PSPG-box motif（图3，WAPQLLILSHPSVGGFLTHCGWNSVLEGI SVGVPMVTLPLFADQ），被认为是UDP-glcouse结合区域。IPR中尚未明确分类的结构域包括位于1 ~ 447 bp的UDP–糖基转移酶73C1家族相关结构域（PTHR11926：SF146，UDP-GLYCOSYLTRA NSFERASE 73C1-RELATED）、位于9 ~ 441 bp位的UDP–糖基转移酶/糖原磷酸化酶超家族结构域（SSF53756，UDP-Glycosyltransferase/glycogen phosphorylase superfamily）和位于307 ~ 413 bp的功能未知结构域（G3DSA：3.40.50.2000，Unintegrated signatures）。