鸡冠花红分光光度法测定血清白蛋白的研究

中国卫生检验杂志"##%年*月第*%卷第*期!EH25F8F\4M15J=4G.FJ=3H;J741J341ISF>H54=4@I，\J5"##%；[4=*%!]4*’

【论著】

鸡冠花红分光光度法测定血清白蛋白的研究

孙!伟，尚智美，韩军英，焦!奎

（青岛科技大学化学与分子工程学院，山东青岛!",,#$"）

［摘要］!目的：建立一种灵敏而简单的分光光度法测定血清白蛋白的新方法。方法：在-.’/#的0123345+64725845（0+6）缓冲溶液中，鸡冠花红与蛋白质相互作用形成一种生物超分子复合物，导致鸡冠花红发生褪色反应，最大吸收波长不变，但吸光度值降低，利用吸光度值的变化可以对蛋白质进行分光光度分析。结果：在最佳实验条件下，最大吸收波长为%’,59，表观摩尔吸光系数为"/,:*#%;<94= >9，测定人血清白蛋白的线性范围为#/%?,#/#9@<;，工作曲线为!!A

#/##’"B#/###&"（9@<;），应用于实际人血清样品的测定，结果同经典的考马斯亮蓝C+"%#法一致。结论：本方法简单、灵敏、选择性好，可用于实际人血清样品的测定。［关键词］!分光光度法；人血清白蛋白；鸡冠花红；褪色反应

［中图分类号］!6$$,/*!!!!［文献标识码］!D!!!!［文章编号］!*##$+&,&%（"##%）#*+###’+#"

!"#$%&’"(’%’)#%&*$+#%#&)*,-%*’,’.(/)-,0#&/)-12/)*,/0*,3-)-&-,%(

#$%&’(，#)*%+,)(-.’(，/*%0$%-1(%+，0(*23$(

（E4==F@F4GEHF92831IJ5KL4=F>M=J1N5@25FF125@，O25@KJ4P52QF1823I4GR>2F5>FJ5KSF>H54=4@I，O25@KJ4",,#$"，EH25J）［420%&-$%］!526#$%*7#：S4F83J7=28HJ8F58232QFJ5K829-=F8-F>314-H4349F312>9F3H4KG413HFKF3F1925J32454G3HF>453F534GJ=T7M925/8#%(’+0：D724+8M-F194=>M=J1>49-=FUVJ8G419FKVHF5J9J1J53H253F1J>3FKV23HHM9J58F1M9J=7M925（.RD）253HF-.’/#0123345+64725845（0+6）7MGGF184=M3245，VH2>H1F8M=3FK253HFKF>1FJ8F4G3HF9JU29J=J78417J5>F4GJ9J1J53H/R43HFGJK25@8-F>314-H4349F312>KF3F1925J32454G.RDVJ8F83J7=28HFKM825@3HFK2GGF1F5>F84GJ78417J5>F/9#0/1%0：P5KF13HF4-329J=>45K232458，3HF>4=4M14GJ9J1J53HJ3%’,591FKM>FK，VH2>H>4M=K7FM8FKG41KF3F>325@4G.RD/SHF94=J1J7841-32Q23I4G3HF1FTJ>324584=M3245VJ8"/,:*#%;<94= >9，J5K3HF=25FJ11J5@FG41.RDKF3F1925J3245VJ8#/%?,#/#9@<;V23H3HFV41W25@>M1QFJ8!!A#/##’"B#/###&"（9@<;）/SH289F3H4KVJ8GM13HF1M8FK25KF3F>325@HM9J58F1M9J=7M9258J9-=FJ5K3HF1FT8M=38VF1F25@44KJ@1FF9F53V23H3HJ34GE449J882F712==2J537=MFC+"%#9F3H4K/:’,$1/0*’,：SHF9F3H4KVJ88F58232QF、J>>MT1J3FJ5K34=F1J53349J5IG41F2@58M783J5>F8，23>J57FM8FKG413HF1FJ=8J9-=FKF3F1925J3245/［;#<=’&+0］!R-F>314-H4349F31I；.M9J5RF1M9D=7M925；D9J1J53H；XJK25@1FJ>3245!!蛋白质是生物体的基础物质之一，是生命活动的基础，其定量分析具有重要意义。目前研究最多、应用最广的是吸光

［*］［"］［’］

光度法、荧光光度法和共振光散射法等。吸光光度法

>?材料与方法*/*!材料

人血清白蛋白（.RD，上海生物制品研究所）*/#@<;储备液，$Y冰箱保存；*/#:*#+’94=<;鸡冠花红储备液（天津市天新精细化工开发中心），使用时再进行稀释；#/"94=<;的0123345+64725845（0+6）系列缓冲溶液；正常人血清样品（青岛科技大学校医院提供）。所用试剂均为分析纯，实验用水为"次石英蒸馏水。EJ1I%#Z147F型紫外+可见分光光度计（澳大利亚[J12J5公司）；(%"型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；-.R+"%型酸度计（上海雷磁仪器厂）。*/"!方法

在*#9=的比色管中依次加入-.’/#的0+6缓冲溶液’/#9=，*/#9=*/#:*#+’94=<;鸡冠花红和—定量.RD溶液，用水定容至刻度，摇匀后于室温下静置反应"#925。以试剂

因其简便、快速、经济和准确等特点而得到广泛应用。蛋白质可以与某些有机染料在一定条件下结合，引起染料颜色变化，进而可用于蛋白质的定量分析，已经研究的染料有铍试剂、锌试剂等。鸡冠花红是一种偶氮类生物染色剂，其分子结构中含有大的亲水性基团，易溶于水，在酸性条件下，带负电荷，易于和蛋白质发生结合作用。本文将它作为光度探针应用于蛋白质的分光光度分析，利用其与蛋白质结合反应后导致溶液吸光度值降低的特点，建立了褪色分光光度法测定蛋白质的新方法，应用于样品测定，结果令人满意。

［基金项目］!国家自然科学基金（"#$#%##&，"#’(%#"#）；中国博

士后科学基金（"##’#’’$)"）

［作者简介］!孙伟（*)(%+），男，博士后，副教授，主要从事生物

分析化学研究。

空白为参比，在室温下用*>9比色皿在%’,59处测定溶液的吸光度值。其中试剂空白记为D#，含有血清白蛋白的记为D，计算!!A!#+!。

7

!"结果与讨论

中国卫生检验杂志!))-年#月第#-卷第#期$?><:KMKS0LF:C10T’KC1E>3CU0FCE0FQAKG>:0104Q，SC:!))-；N01#-$B0#

反应!)/<:即达到反应平衡，若在()=或(9=下反应，则反应#)/<:完成，体系具有很好的稳定性，吸光度值在!>内基本保持恒定。!"($干扰物质的影响

对常见的金属离子、氨基酸、葡萄糖等物质对该体系的干扰进行了试验，结果如表#所示，由表#中可以看出，常见的干扰物质对测定的影响不大。

实验了!%?@，5@5，?A6*等表面活性剂对反应的影响。!"#$紫外%

可见吸收光谱图

图#"紫外$可见吸收光谱图

#"&’(")*%+缓冲溶液,#"-.#)%-/0123鸡冠花红；!"#,!))")/423’56；("#,7))")/423’56；

7"&’(")*%+缓冲溶液,7))")/423’56

图#为鸡冠花红及其与’56复合物在())89)):/范围内的紫外可见吸收光谱图。在&’(")的*%+缓冲溶液中，鸡冠花红在-(;:/处有最大吸收波长（曲线#）；’56无吸收峰（曲线7）。当二者混合后出现褪色现象，最大吸收波长不发生变化，但吸光度值明显降低，蛋白质加入量越大，褪色现象越明显（曲线!，(），表明两者发生结合反应形成新的复合物。选择-(;:/为测定波长，利用其吸光度值降低可以对’56进行测定。

!"!$最佳实验条件的选择

!"!"#$酸度的影响$试验了溶液&’值对吸光度的影响，结果如图!所示。由图中可以看出，在&’#"(8-")的范围内，在&’(")时的!!变化最大，其最佳用量范围为(")/1，所以实验选用(")/1&’(")的*%+

缓冲溶液。

图!"%&值对结合反应的影响

不同&’的*%+缓冲溶液,#").#)%7/0123

鸡冠花红,-)")/423’56

!"!"!$鸡冠花红用量的影响$实验结果表明，当固定’56的浓度为!"-/423时，鸡冠花红的浓度在#").#)%7

/0123时

吸光度的差值最大且稳定，所以选择鸡冠花红的最终浓度为

#").#)

%7

/0123。

!"!"($反应时间、温度和体系的稳定性$考察了反应时间和温度对结合反应的影响，结果发现该反应的速度很快，室温下

结果表明，中性表面活性剂对体系的影响不大；而阴阳离子型表面活性剂对测定的影响较大。

考察了BC?1对体系的影响，随着BC?1的加入，!!值逐渐减小，表明BC?1的存在具有离子屏蔽作用，会极大地影响两者的反应，说明两者之间可以通过静电作用而相互结合。

表#"常见物质对’()(*+,-&./测定的影响

物质名称浓度（/0123）相对偏差（D）物质名称浓度（/423）相对偏差（D）*C!,#").#)%-("#(?<EF<GCG<HI")("#7JK(,#").#)%-%("#(41LG0MKI")7"-7?L!,

#").#)%-

!"#73%NC1<:K#)")%#"I#?H!,

#").#)%-#"-73%3KLG<:K

#)")%("IOB<

!,

#").#)

%-

)"II3%P1LEC/<:K#)"))"O!?0!,#").#)%-

#"99

3%3QM<:K

#)")

(";#

!"7$标准工作曲线

在最佳条件下，按照实验方法绘制了测定人血清白蛋白的工作曲线。当’56浓度在)"-8;)")/423范围内与!!呈良好的线性关系，线性回归方程为!!R)"))(!,)")))I"

（/423），（#RO，$R)"OO#），复合物的表观摩尔吸光系数"为!";.#)-32/01 G/，##次平行测定的相对标准偏差为("!!D。!"-$样品分析

在最佳条件下，对人血清样品中的白蛋白进行了定量分析，结果如表!所示。与经典的考马斯亮蓝P%!-)法结果一致，方法的回收率在O-"-D8#)7"7D之间，令人满意。

表!"人血清样品中白蛋白含量的测定

样品本方法+5@回收率考马斯亮蓝P%!-)光度法

（423）（D，#R7）（D）

（423）#O!"()("-O-"-O("#;!

#)!"!7

!"-#)7"7

OO"-!

［参考文献］

［#］胡秋娈"蛋白质%铍试剂体系的吸收光谱研究及分析应用［S］"

理化检验%化学分册，!)))，(;（O）：(II%(O)"

［!］易平贵，刘俊峰，商志才，等"荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质

的结合反应［S］"光谱学与光谱分析，!))#，!#（;）：I!;%I!I"［(］李树伟，李娜，赵凤林，等"用铬黑A作为共振光散射探针测定蛋

白质［S］"分析化学，!))!，()（;）：9(!%9(-"

（收稿日期：!))7%)9%)O）