鸡关节软骨Ⅱ型胶原的制备

2007, Vol. 28, No. 04

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食品科学

型胶原的制备

曹　

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慧

江苏　无锡　　　　　　　２１４０３６）

摘　　　要

使ＩＩ

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型胶原由不溶性转变为可溶性

及酶解时间

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研究表明

　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

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电泳

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关键词

鸡关节软骨

最佳酶解时间

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２４ｈ

确定最佳的酶浓度

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Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｕｒｅ　Ｔｙｐｅ　ＩＩ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｃｋｅｎ　Ａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ

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　　ＣＡＯ　Ｈｕｉ

Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｆｒｏｍ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ．　Ｔｈｅ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｗａｓ

ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐｅｐｓｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ａｃｉｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ．　Ｂｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ，　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌｐｅｐｓｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ．　Ｔｏ　ｇｅｔ　ｔｈｅ　ｐｕｒｅｒ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ，　ＤＥＡＥ－ｓｅｐｈａｌｏｓｅＣＬ　６Ｂ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｅｒ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ　ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｅｌｕｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｒｅ　１％　ｐｅｐｓｉｎ　ｆｏｒ　２４　ｈ．　Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｂｙ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｒｅ　６７％　ａｎｄ　８１％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，　ＲＰ－ＨＰＬＣ，　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｖｉｏｌｅｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

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ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ｐｒｏｄｕｃｔ．收稿日期

曹慧（１９７６－

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）

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研究方向为功能性食品

抑制率为

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１４．４％

［１］［２］［３］

７０％的乙醇溶液按料液比１：２

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５

水浴中先预热浸提３０ｍｉ

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ｎ

的

［４］［５］［６］［７］［８］［９］

在此条件下得到紫背天葵中总黄酮提取率

为５９．７

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％

提取液对ＤＰＰＨ

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自由基有较强的清除作用

在样品液黄酮浓度

为０．６６ｍｇ／ｍｌ

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时的清除效果最好

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紫背天葵提取液有一定的抗脂质氧化能力

张菊平，　张兴志，　肖涛．　紫背天葵的营养保健作用［Ｊ］．　蔬菜，　２００３（２）：４１－４２．

张林和，　屠春燕，　于文涛，　等．　紫背天葵中营养成分及总黄酮分析［Ｊ］．氨基酸和生物资源，　２００４，　２６（３）：　３－５．

郭长江．　食物类黄酮物质的营养学意义［Ｊ］．　中国食物与营养，　２００４（３）：　３８－４０．

张德权，　台建祥，　付勤．　生物类黄酮的研究及应用概况［Ｊ］．　食品与发酵工程，　１９９９，　２５（６）：　５２－５７．

张国辉，　马辰．　黄酮类化合物药动力学研究进展［Ｊ］．　中草药，　２００４，３５（５）：　５８２－５８５．

郭亚健，　范莉，　王晓强，　等．　关于ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＯＨ比色法测定总黄酮方法的探讨［Ｊ］．　药物分析杂志，　２００２，　２２（２）：　９７－９９．

丰永红，　于淑娟，　李国基，　等．　ＤＰＰＨ法测甘蔗提取物抗氧化活性研究［Ｊ］．　甘蔗糖业，　２００３（１）：　３１－３３，　５０．

王继锋，　王石泉，　汤国枝，　等．　山楂原花色苏德抗氧化作用研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，　２０００，　１３（２）：　３４－３６．

杨荣华，　田迪英．　１０种花色苷果蔬抗氧化活性的比较［Ｊ］．　食品与发酵工业，　２００４，　３０（４）：　５－７．

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ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ

其中ＩＩ

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型胶原蛋白主要由三条相同的

）

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链以螺旋的方式构成软骨的基本结构

ＩＩ型胶原蛋

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白特有的结构和化学组成使其在生物医学材料

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组织工程

近年来的研究表明ＩＩ型胶原还可以作为药物和保

健品来防治类风湿性关节炎（ＲＡ）

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［２］

其病

因主要是由Ｔ细胞因子引起的关节组织内对特异性隐蔽

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抗原的自身免疫反应

因

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此可通过口服

９０

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％

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型胶原

ＩＩ

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型胶原标准品其余化学试剂均为国

产分析

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纯

ＨＰ－１１００高效氨基酸

分析仪（１１：１００００）　　　　Ａｇｉｌｅｎｔ公司

ＵＶ１１００型紫外－可见光分光光度

计　　　　Ｕｎｉｃｏ（上海）仪器有限公司

将样品置于水解管中

加入６ｍｏｌ／Ｌ　

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盐酸真空封管水解２４ｈ

蒸干盐酸

稀

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释

胶原含量（％）＝（羟脯氨酸含量／１４．４）１００［３］

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总糖含量

型胶原粗制品的制备

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从鸡关节软骨表面剔除残肉

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脱脂

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以８０００转４

分别加入质量分数为２

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％

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４

149

Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号

离心

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２０ｍｉｎ

所得沉淀用０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＨＡｃ

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透析

１．３．３ＩＩ型胶原的纯化１．３．３．１

离子交换色谱法

将ＩＩ型胶原粗制品溶解于０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＨＡｃ

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中

在０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ

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０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ的初始缓冲液中透析平衡

１ｃ

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ｍ

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上样体积

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先采用０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ／０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ洗脱

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经过上述条件洗脱后收集到两个洗脱峰

取含羟脯氨

酸的第一个洗脱峰用３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ

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盐析１．３．３．２

水洗法

将ＩＩ

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型胶原粗制品置于去离子水中以１００００转

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４

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透析

分离胶浓度为

８％（Ｗ／Ｖ

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）１．３．４．２

ＲＰ－ＨＰＬＣ色谱将纯化后的ＩＩ型胶原溶解在０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＨＡｃ

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中

ｍ

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的微滤膜

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色谱柱

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２５０ｍｍ）

Ｂ为８０％乙腈（Ｖ／Ｖ

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）

流速

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１ｍｌ／ｍｉｎ

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１１０

采用Ａｇｉｌｅｎｔ１１００

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高效液相分析仪分析水解液中氨基酸组成

在

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２００１．３．７

ＩＩ

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型胶原提取率和纯度的计算

１００

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

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原料中胶原的含量

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食品科学

１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　总蛋白含量

２结果与分析

２．１

鸡关节软骨成分分析

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鸡关节软骨中含有丰富的胶原蛋白

９０％

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［７］

总糖和脂

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肪的含量则相对偏低鸡关节软骨是提取ＩＩ型

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胶原蛋白理想的原料

在提取过程中必须使

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用胃蛋白酶切除三股螺旋链两端的端肽

Ｈｓｉｕ等使用了２％的胃蛋白酶

在

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１

下酶解５ｄ提取ＩＩ型胶原

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［９］

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选用粘度为评定指标

从而确定ＩＩ型胶原的酶解时间及酶的最

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佳添加量底物粘

度呈逐渐上升趋势但

达到最大粘度值的各个酶解产物中胶原蛋白的含量和提

取率没有显著差异（见表

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２）

）

ｓ时间（ｈ）

图１　　　胃蛋白酶浓度对ＩＩ型胶原粘度的影响

Ｆｉｇ．１　　　　　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｐｓｉｎ　ｏｎ　ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　ＩＩ

ｃｏｌｌａｇｅｎ

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Ｗ／Ｗ）

２１０．５０．３提取率（％）

５４．３

５５．６

５４．８

５２．６

ＩＩ

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型胶原蛋白含量（％

同酶解条件下胶原蛋白酶解都已完成

当

酶的添加量为２％（Ｗ／Ｗ）和１％（Ｗ／Ｗ）

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时

约在２

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０

当酶的添加量

为

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０．５％（Ｗ／Ｗ）时

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完成酶解所需的时间最长

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从生产成本和时间考虑酶解时间为２４

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ｈ

胶原蛋白含量为８９．８

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％

表３　　　　两种纯化方法对ＩＩ型胶原提取率及纯度的影响

Ｔａｂｌｅ　３　　　　　　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ

ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ提取率（％）

纯度（％）色谱分离法６７９７水洗法

８１

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９３．４

采用ＤＥＡＥ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　６Ｂ离子交

换色谱能很好的分离ＩＩ型胶原与蛋白多糖

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［４－６］

这与经离子交换色谱柱纯化之前

易导致ＩＩ

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型胶原变性的前处理步骤有关

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耗时长的缺点

根据ＩＩ型胶原不

溶于去离子水的性质将ＩＩ型胶原在去离子水中重复洗涤

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除去杂质提取

率可以达到８１

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％

提取率也较高

从图３可见分别经过离子交

换色谱及水洗的ＩＩ型胶原与Ｓｉｇｍａ公司标准品相比均具

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有很高的纯度ＩＩ型胶原

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是由三条相同的

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带和少量的

其保留时间分别为１０．２３３及１０．３００ｍｉｎ（在

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151

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Ｍ

１

２

３

４

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５

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５００

２００ｋＤａ

ｍＡＵ

４００３００２００１０００－１００

０

Ｍ

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１

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５

２

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４

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１０时间（ｍｉｎ）

ａ．经过离子交换色谱纯化的样品

２０

通过峰面积积分算出的纯度分别为

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９７％２．５

ＩＩ型胶原的氨基酸组成及紫外光谱由表４

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可见

其中甘氨酸约

占总氨基酸的１／

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３还含有较多的丙氨酸

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缺乏色氨酸

这

与ＩＩ

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型胶原特殊的结构及氨基酸组成有关

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此外

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ｍＡＵ

６００４００２０００

０１０时间（ｍｉｎ）

ｂ．Ｓｉｇｍａ标准样品

２０

图４　　　　ＩＩ型胶原的ＲＰ－ＨＰＬＣ图谱

Ｆｉｇ．４　　　　　　ＲＰ－ＨＰＬＣ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ

胶原粗制品提取的最适胃蛋白酶添加量为１

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％

型胶原比较理想的原料

型

采用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｌｏｓｅ　ＣＬ　６Ｂ

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离子交换柱

表４　　　　ＩＩ型胶原的氨基酸组成

Ｔａｂｌｅ　４　　　　　　Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ

**

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*

2007, Vol. 28, No. 04

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食品科学

倪　辉

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２

（１．四川农业大学信息与工程技术学院食品科学与工程系

２．集美大学生物工程学院

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目的

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提取时间

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倍原料重的丙酮要苦味物同时提取出来

苦味

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物

诺米

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林

溪蜜柚中主要苦味物（柚皮苷

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脱脂溶剂的选择对提取率的影响

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结果结论

吴光斌２

方法

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溪蜜柚中主要苦味物提取的最佳工艺条件为２０

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采用本实验所确定的提取方法可将蜜柚中的三种主

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ＮＩ　Ｈｕｉ

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２ＣＡＩ　Ｈｕｉ－ｎｏｎｇ２，

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＊

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｊｉｍｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｘｉａｍｅｎ　　　　　　　　　　３６１０２１，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　

２００６－０４－１１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊通讯作者

基金项目

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集美大学科研基金项目

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作者简介

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硕士研究生

福建省自然科学基金项目（２００６Ｊ００７６）

［１］［２］顾其胜，　蒋丽霞．　胶原蛋白与临床医学［Ｍ］．　上海：　第二军医大学出版社，　２００３：　６０－６７．

杨晓红，　彭燕豪，　邹海燕，　等．　高纯度猪软骨

［６］

型胶原提取率分别达到６７％和

８１

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％

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型胶原具有较高纯度

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成本低

因此开

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发利用鸡软骨资源用以生产

高效液相色谱

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［７］

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ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｏｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９９３，　２４：　１７２７－１７２９．ＥＤＷＡＲＤ　Ｊ　Ｍ．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｙａｎｏｇｅｎ　ｂｒｏｍｉｄｅｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９７３，　１７：　３１５３－３１５９．

ＰＩＥＰＥＲ　Ｊ　Ｓ，　ＶＡＮ　ＤＥＲ　ＫＲＡＡＮ　Ｐ　Ｍ．　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ｔｙｐｅ