鸡内源性类J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆及分析

第２１卷第１期病毒学报Ｖ０１．２１Ｎｏ．１

１１１

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鸡内源性类Ｊ亚群禽白血病病毒ｇｐ８５基因的克隆及分析

杨玉莹１，秦爱建２，顾玉芳３，赵振华３

（１．内蒙古畜牧科学院，呼和浩特０１００３０；２．扬州大学动物医学系，扬州２２５００９；

３．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特０１００１８）

摘要：为深入探讨Ｊ亚群禽白血病病毒（Ａｖｉａｎ

ｌｅｕｋｏｓｉｓｖｉｒｕｓｓｕｂｇｒｏｕｐ

Ｊ，ＡＬｖ＿Ｊ）的亚群特性，利用ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５基因

两侧的序列片段为引物，从正常ＳＰＦ蛋鸡、商品肉鸡和ＤＦｌ细胞基因组中完整地扩增了内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因。肉鸡和ＤＦｌ细胞内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５基因同源性达９９．９％；ＳＰＦ蛋鸡内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５基因与肉鸡和ＤＦｌ细胞的内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因之间同源性达９５．６％、９５．３％。三种不同来源的内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因ＤＮＡ与ＩＭＣｌ０２００株ＡＬＶ－Ｊ的ｇｐ８５基因的同源性分别为９１．８％、９４．１％、９４．０％；与ＡＬＶ－Ｊ原型株ＨＰＲＳ－１０３ｇｐ８５基因的同源性分别为９５．６％、９８．３％、９９．９％。内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５序列与外源性ＡＬＶ－ＪｇＰ８５基因具有相似或一致的ＯＲＦ和Ｊａｍｅｓｏｎ—Ｗｏｒｌｆ抗原表位优势。

关键词：内源性反录病毒；内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５基因；ＤＮＡ克隆及分析中图分类号：ｓ８５２．６５９．３

文献标识码：Ａ

文章编号：１０００—８７２１（２００５）０１—００５４—０６

Ｊ亚群禽白血病病毒（Ａｖｉａｎｌｅｕｋｏｓｉｓ

ｖｉｒｕｓｓｕｂ—

本研究利用Ｊ亚群ＡＬＶｇｐ８５基因信号序列下ｇｒｏｕｐ

Ｊ，ＡＬＶ—Ｊ）出现以来的十年间，ＡＬＶ—Ｊ已然在

游的一段序列为引物，从我国商品肉鸡（ＡＡ）、ＳＰＦ

世界范围内广泛传播。由于诱发肿瘤、患鸡胴体废

自来航鸡和ＤＦｌ细胞１６１（源自０系来航鸡）基因组弃、产蛋性能下降和其它未知的对鸡群生产性能的中，完整地扩增出内源性类Ｊ亚群禽白血病病毒影响，ＡＬＶ—Ｊ给养禽业带来巨大经济损失和严重威ｇｐ８５基因，并与国外由其它品系宿主基因组克隆的胁…。野外调查和实验室研究表明：Ｊ亚群ＡＬＶ比内源性ＥＡＶ—ＨＰ进行了分析比较。同时对比分析其它外源性亚群ＡＬＶ有更快更强的水平传播能

了外源性ＡＬＶ—Ｊ毒株ｇｐ８５基因特性，以期深入探

力；在肉鸡和蛋鸡鸡胚９～１１日龄免疫功能尚不健

讨ＡＬＶ－Ｊ的生物学特性和致病机理。

全时感染ＡＬＶ—Ｊ，与其它亚群一样容易导致免疫耐受，形成病毒血症而无抗体免疫应答。然而，孵化后材料与方法

早期感染ＡＬＶ—Ｊ后，肉鸡和蛋鸡却表现出明显不同的两种反应。多数品系的蛋鸡能够产生中和抗体中１预备试验：非ＡＬＶ－Ｊ感染鸡的选择

由于我国目前尚无

和病毒，表现为一过性病毒血症；而所有品系的肉鸡ＳＰＦ肉鸡，而自然状态下肉鸡群中ＡＬＶ－Ｊ感染率又较高，因感染后有一定数量宿主却没有产生中和抗体，呈现此用于正常肉鸡基因组ＤＮＡ提取的样品须确定无ＡＬＶ－Ｊ持续性病毒血症Ｌ２Ｊ。禽内源性反录病毒ＥＡＶ—ＨＰ感染。本研究中实验肉鸡经ＡＬＶ－ＪＥＬＩＳＡ抗体检测、病毒（或称为ｅｖ／Ｊ）是最近发现的内源性禽反录病毒分离实验均阴性，且病理组织学观察无ＡＬＶ病理变化的肉（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ

ａｖｉａｎ

ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，ＥＡＶ）ＥＡＶ一０的新成

鸡方能进入样品ＤＮＡ的提取。

员Ｌ３’４Ｊ。既然Ｊ亚群ＡＬＶ的囊膜蛋白基因与ＥＡＶ—

蛋用型鸡基因组选用ＳＰＦ鸡胚的肝组织，经病毒分离ＨＰ

ｅｎ＂ｏ基因有９７％以上的同源性，相信这种宿主

实验阴性后作为ＤＮＡ提取的样品。对ＡＬＶ—Ｊ的免疫耐受现象与胚胎时期内源性ＥＡＶ—

２实验材料

预备实验肉鸡来自２个内蒙古肉种鸡场。

Ｊ。早期感染肉鸡

ＳＰＦ种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。禽白血病Ｊ亚群抗体检测试剂盒为ＩＤＥＸＸ产品。

ＡＬＶ＿Ｊ特异性单克隆抗体（单抗）ＪＥ９【７Ｊ和ＤＦｌ细胞由受的诱导与某些ＥＡＶ—ＨＰ位点的表达有关，可能有扬州大学秦爱建教授提供。特异性ＡＬＶ－ＪＰＣＲ采用两对引物，按文献【８Ｊ合成（ＰＣＲＩ扩增产物约２．２ｋｂ，正向引物５’一

收稿日期：２００３

０９—０２；修回日期：２００４—０６—２７

睨ＴＧＣＴ

ＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＡ

ＣＴ，反向引物５＇－ＡＧＴ

作者简介：杨玉莹（１９６２一），男，天津籍，研究员，博士，研究方向ＴＧＴＣＡＧ

ＧＧＡＡＴＣＧＡＣ。ＰＣＲＩＩ扩增产物５４５ｂｐ。正向引

为动物病毒学及分子生物学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｎｇｙｙｅｎ＠ｍｓｎ．ｔｏｍ

物Ｈ５为５＇－ＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡ

ＡＧ，反向引物

ＨＰ的已咒砂基因低水平表达有关【５并不全部发展为免疫耐受的现象提示，这种免疫耐其它未知因素的参与。

１期杨玉莹等：鸡内源性类Ｊ亚群禽白血病病毒ｇｐ８５基因的克隆及分析

５５

Ｈ为５＇－ＣＧＡ

ＡＣＣＡＡＡ

ＧＧＴＡＡＣＡＣＡＣＧ）。内源性类Ｊ

亚群禽白血病病毒ｇｐ８５基因的ＰＣＲ扩增引物采用克隆表达ＡＬＶ－ＪＩＭＣａ０２∞株ｇｐ８５基因时使用的引物【９１（为叙述方便称其为ＰＣＲⅢ。正向引物位于ｇｐ８５信号序列的下游，５’一

ＣＴＧＧＡＴＣＣＡ

ＴＧＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＣＣ

ＣＡＧ，含ＢａｍＨＩ酶切位点。反向引物为５＇－ＴＡＣ

ＴＧＣＡＧＴ

ＴＡＧＣＧＣＣＴＧ

ＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＡ０Ｃ，含Ｐ站Ｉ酶切位点）。

实验肉鸡采血致死，分离血清。取肝组织一７０℃保存用于病毒分离实验，并作为提取肉鸡基因组ＤＮＡ的待选样品。同时取肝、脾、肾、十二指肠、胰腺、性腺、心肌、骨骼肌、脑和骨髓组织，１０％福尔马林固定，用于制作组织切片进行病理学观察。

ＳＰＦ种蛋孵化至１８日龄，取肝组织进行与肉鸡肝组织相同的检测实验。

３预备试验检测方法ＡＬＶ－ＪＥＬＩＳＡ抗体检测：检测待选实验肉鸡分离的血清，实验方法及结果判定按ＩＤＥＸＸ说明书进行。ＤＦｌ细胞接种和ＩＦＡ检测：按文献【８０将待选肝组织悬液接种ＤＦｌ单层细胞，传代培养１５天后进行ＪＥ９单抗的ＩＦＡ检测。病理组织学检查采用常规组织切片制作。４基因组ＤＮＡ提取

提取样品为阴性结果的肉鸡。ＳＰＦ

鸡胚肝组织和正常ＤＦｌ细胞。参照文献【１０Ｊ提取基因组ＤＮＡ。

５

内源性类ＡＬｖ．ＪＲｐ８５及ＡＬＶ．Ｊ特异性引物ＰＣＲ商品

肉鸡、ＳＰＦ白来航鸡和ＤＦｌ细胞基因组样品ＤＮＡ均分别进行３对引物的ＰＣＲ。特异性ＰＣＲ反应【８Ｊ用于鉴定基因组中无ＡＬＶ－Ｊ前病毒，设无模板对照和ＰＣＲ反应Ⅲ为非特异性对照。ＰＣＲ反应ｍ【９Ｊ用于扩增基因组中内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５序列。设无模板对照和无引物对照。６目的基因克隆

将扩增于ＳＰＦ蛋鸡基因组ＤＮＡ的类

ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５目的基因与ｐＧＥＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ进行连接，方法按

文献凹Ｊ。

７重组质粒的酶切鉴定

连接产物转化ＤＨ５ａ细胞及碱裂

解法小量提取质粒ＤＮＡ【１０Ｊ后进行ＥｃｏＲＩ单酶切和ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切鉴定。设ｐＧＥＭ—ＩＭＣｇｐ８５旧Ｊ为外源性ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５基因对照。

８

ＤＮＡ测序和分析将克隆株和ＰＣＲ扩增物直接送上海

生工生物工程有限公司测序。用ＤＮＡｓｔａｒ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ５．０１）核酸分析软件分析测序结果。

９引用基因序列本研究中引用序列源自ＮＣＢＩ

ＧｅｎＢａｎｋ。

ＧｅｎＢａｎｋ索取号为：ＡＤＯＬ０系来航鸡ＥＡＶ－ＨＰ，ＡＦ２４７３９２；２１系肉鸡（Ｃａｌｌｕｓ

ｇａｌｌｕｓ

ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）ＥＡＶ－肿，ＡＪ２３８１２５；ｓＪ

ＥＡＶ－ＨＰ（Ｓｏｎｎｅｒａｔ’ｓｉｕｎｇｌｅ

ｆｏｗｌ，Ｃａｌｌｕｓ

ｓｏｎｎｅｒａｔｔｉ），

ＡＪ２３８１２３；ＲＪＥＡＶ－ＨＰ（Ｒｅｄ

ｊｕｎｇｌｅｆｏｗｌ，Ｃａｌｌｕｓ

ｇａｌｌｕｓ），

ＡＪ２３８１２０；Ｃａｌｌｕｓ

ｇａｌｌｕｓ

ｃｌｏｎｅ４—１

ａｖｉａｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ

ｖｉｒｕｓ，

ＡＦｌ２５５２８；ＡＬＶ—ＪＩＭＣｌ０２∞株ｅｎ＇ｏ基因，ＡＹ２３４０５１；ＡＬＶ－Ｊ

ＨＰＲＳ－１０３株ｇｐ８５基因编码的氨基酸序列，Ｚ２３６９７３。结

果

１预选样品ＤＮＡ

选取经ＡＬＶ—ＪＥＬＩＳＡ抗体检测、ＤＦｌ细胞接种１５天后ＩＦＡ检测阴性、病理学观察无ＡＬＶ病变的肉鸡肝组织和ＳＰＦ蛋鸡胚肝组织ＤＮＡ样品各５

个，样品序号分别称其为ＭＴＣ（ｍｅａｔ—ｔｙｐｅ

ｃｈｉｃｋｅｎ，

ＭＴＣ）１～５号和ＷＬＣ（ｗｈｉｔｅｌｅｇｈｏｒｎ

ｃｈｉｃｋｅｎ，ＷＬＣ）

１～５号。

２类ＡＬＶ．Ｊｇｐ８５内源性序列的ＰＣＲ

采用ＡＬｖ－Ｊｇｐ８５基因两侧序列片段为引物，对样品ＤＮＡ进行扩增（ＰＣＲ反应Ⅲ），ＷＬＣｌ～５号、ＭＴＣｌ～５号、正常ＤＦｌ细胞样品ＤＮＡ均呈现一致的扩增。无模板对照和无引物对照均为阴性。ＷＬＣｌ

５的扩增物为９１６ｂｐ。ＭＴＣｌ～５号、正常

ＤＦｌ细胞样品ＤＮＡ的扩增物为９４６ｂｐ。

３

ＡＬＶ．Ｊ特异性ＰＣＲ

ＷＬＣｌ～５、ＭＴＣｌ～５和正常ＤＦｌ细胞样品

ＤＮＡ用Ｊ亚群ＡＬＶ特异性引物进行ＰＣＲ反应Ｉ和ＰＣＲ反应Ⅱ扩增，３种样品ＤＮＡ均无阳性扩增（图１）。无模板对照和无引物对照均为阴性。作为非特异性对照的ＰＣＲ反应Ⅲ呈现阳性扩增。说明样品ＤＮＡ中无ＡＬＶ—Ｊ前病毒插入，ＰＣＲ反应Ⅲ阳性扩增物为内源性序列。方便起见，分别称其为类

ＡＬＶ＿Ｊ

ｇｐ８５的内源性序列ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、

ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ。

图１肉鸡、ＳＰＦ鸡和ＤＦｌ细胞基因组

不同引物的ＰＣＲ分析

Ｆｉｇｕｒｅ１

ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅａｔ—ｔｙｐｅｃｈｉｃｋｅｎ．ＳＰＦ

ｅｇｇ—ｔｙｐｅ

ｃｈｉｃｋｅｎａｎｄＤＦｌ

ｇｅｎｏｍｅ

Ｌａｎｅｌ．１ｋｂＤＮＡＬａｄｄｅｒ；２，３，４．ＤＦＩ

ｇｅｎｏｍｅ；５，６，７．ＭＴＣ２；８，９，

１０．ＷＬＣ２；２，５，８．ＰＣＲⅢ；３，６，９．ＰＣＲＩＩ；４，７，１０．ＰＣＲＩ；１１，

１２．ＰＣＲｍ

ｗｉｔｈｏｕｔｔｅｍｐｌａｔｅ；１３，１４．ＰＣＲ１１

ｗｉｔｈｏｕｔｔｅｍｐｌａｔｅ；

１５．１６．ＰＣＲ１ｗｉｔｈｏｕｔｔｅｍｐｌａｔｅ．

４类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５内源性序列基因克隆及酶切鉴

定

将源自ＳＰＦ鸡胚肝组织样品ＤＮＡＷＬＣ２号的扩增物与ｐＧＥＭ—Ｔ

Ｖｅｃｔｏｒ进行连接，转化ＤＨ５ａ后

５６

病毒得到内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５基因克隆ｐＧＥＭ—ｗＬ—Ｃｇｐ８５一ｌｉｋｅ质粒。用Ｅ∞ＲＩ单酶切鉴定重组质粒ｐＧＥＭ—ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ，电泳结果显示，克隆的类ＡＬｖ—Ｊｇｐ８５内源性序列片段与原样品ＤＮＡＷＬＣ２的扩增物大小相等，具有特异性（图２）。用ＢａｒｎＨ

Ｉ／ＰｓｔＩ双酶切重组质粒ｐＧＥＭ—ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ则

产生约２６０ｂｐ和６５０ｂｐ的两条目的片段。用ｔＪａｍＨ

Ｉ／ＰｓｔＩ双酶切样品ＤＮＡＷＬＣ２号的扩增物得到

相同的结果（图２）。为证实目的基因的特异性，用

ＢａｍＨＩ／Ｒ￡１分别双酶切ｐＧＥＭ—ＩＭＣｇｐ８５（含有

ＩＭＣａ０２００株ＡＬＶ—Ｊ病毒的ｇｐ８５基因）和ｐＧＥＭ—ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ质粒，电泳结果证明：ＷＬＣ２号的扩增物确实存在ＢａｒｎＨＩ酶切位点，克隆进ｐＧＥＭ—ＴＶｅｃｔｏｒ的目的基因是正确的。ＷＬＣ２号扩增物于第２６０ｂｐ存在ＢａｒｎＨＩ酶切位点，但ＩＭＣｌ０２００株ＡＬＶ—Ｊ病毒的ｇｐ８５基因中不含有ＢａｒｎＨＩ酶切位点。

图２重组质粒ｐＧＥＭ—ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ酶切鉴定

Ｆｉｇｕｒｅ２

Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ

ｅｎｚｙｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＭ－ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ

Ｌａｎｅｌ．１ｋｂ

ＤＮＡＬａｄｄｅｒ；２．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ

ｐＧＥＭ—ＷＬ—

Ｃ瞄５－ｌｉｋｅ

ｄｉｇｅｓｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ＥｃｏＲＩ；３．ＰＣＲＩＩ

ｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ

ＷＬＣ２；

４．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ

ｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＭ—ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ

ｄｉｇｅｓｔｅｄ

ｗｉｔｈ

ＢａｍＨ

Ｉ／Ｐ站Ｉ；５．ＰＣＲ１１１

ｐｒｏｄｕｃｔｓ

ｏｆ

ＷＬＣ２ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈ

ＢａｍＨＩ

ＩＰｓｔ

Ｉ．

５

内源性类ＡＬＶ．Ｊｇｐ８５基因的测序结果

将ｐＧＥＭ—ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ质粒和ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ

（ＭＴＣＥ号扩增物）、ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ扩增物进行测序，测序结果已登陆于ＧｅｎＢａｎｋ，索取号分别为ＡＹ３７５３１６（源自ＳＰＦ蛋鸡）、ＡＹ３７５３１４（源自肉鸡）、ＡＹ３７５３１５（源自ＤＦｌ细胞株）。测序结果中ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ为９１６ｂｐ（含引物）；ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ和ＤＦｇｐ８５一Ｌｉｋｅ为８８６ｂｐ，加上引物为９４６ｂｐ。６内源性类ＡＬＶ．Ｊｇｐ８５基因分析

利用ＭａｐＤｒａｗ（ＤＮＡｓｔａｒ）对ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ与ＡＬＶ—Ｊ原型株

学报

ＨＰＲＳｌ０３、ＩＭＣｌ０２００株进行比较分析，仅有ｗＬ—Ｃｇｐ８５一ｌｉｋｅ于第２６０ｂｐ处存在ＢａｍＨＩ酶切位点，而且于６８２－－７１１位缺失３０个碱基。在ＧｅｎｅＱｕｅｓｔ上对这些类ｇｐ８５序列进行ＯＲＦ分析，它们与外源性ＨＰＲＳ－１０３、ＩＭＣｌ０２００株ＡＬＶ—Ｊ表现了基本一致的分析结果。

将３个不同来源的类ＡＬＶ—Ｊ

ｇｐ８５ＤＮＡＯＲＦ

翻译为氨基酸序列后，预测的ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ和ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ氨基酸序列之间的同源性为９８．７％、９８．３％、９９．４％（表１）；与ＩＭＣｌ０２００株ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５氨基酸序列的同源性分别为９０．３％、９０．６％、９０．３％；与ＨＰＲＳ－１０３９ｐ８５氨基酸序列的同源性分别为９６．０％、９７．７％、９７．４％。

生物进化树分析表明：内源性类ＡＬＶ—Ｊ

ｇｐ８５

基因ＤＮＡ和ＡＬｖ—Ｊ原型株ＨＰＲＳ－１０３高度同源；

翻译的氨基酸序列中仅ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ在ｖｒ３区附

近２２９～２３９位缺失１０个氨基酸（图３）。ＪａｍｅｓｏｎＷｏｒｌｆ抗原表位优势对比分析（图４），ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ与ＨＰＲＳ－１０３９ｐ８５氨基酸序列有类似的抗原表位、疏水性。ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ氨基酸序列２２０和２４５位（ｖｒ３区）抗原表位优势下降，特别是２２０位与ＩＭＣ４０２００株ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５相比明显没有抗原优势。但是，ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ氨基酸序列２４１位却比ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ与ＡＬＶ－Ｊ

ＨＰＲＳ－

１０３９ｐ８５氨基酸序列有明显升高，而与ＩＭＣｌ０２００株

ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５相当。

ｇｐ８５基因与已发表ＥＡＶ．ＨＰ结果的比较分析

对３个不同来源的内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因

与近来已发表的ＥＡＶ—ＨＰ序列进行比较，本次研究获得的３个不同来源的内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因与ＡＤｏＬ０系来航鸡ＥＡＶ—ＨＰ同源性为９７．９％～９９．９％；与２１系肉鸡（Ｇａｌｌｕｓ

ｇａｌｌｕｓ

ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）

ＥＡＶ—ＨＰ（Ｓｏｎｎｅｒａｔ’Ｓｊｕｎｇｌｅ

ｆｏｗｌ，Ｇａｌｌｕｓ

ｓｏｎｎｅｒａｔｔｉ）同源性为

９３．３％～９８．９％；与ＩＵＥＡＶ—ＨＰ（Ｒｅｄｊｕｎｇｌｅ

ｆｏｗｌ，

Ｇａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓ）同源性为９３．６％～９９．２％；与Ｇａｌｌｕｓ

ｇａｌｌｕｓ

ｃｌｏｎｅ４—１

ａｖｉａｎｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ

ｖｉｒｕｓ同源性为

的。内源性类ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ、ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ比

高的同源性（图５）。

．

７内源性类ＡＬＶ．ＪＥＡＶ—ＨＰ同源性为９７．６％～９８．９％；与ＳＪ９７．８％～９９．８％。生物进化树分析表明，此段内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因，在不同品系间是相对稳定ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ基因与已发表的ＥＡＶ一肿序列有更

１期杨玉莹等：鸡内源性类Ｊ溅群禽白血瘸病毒ｇｐ８５袋因的克隆及分析表Ｉ蠢涿经类ＡＬＶ－Ｊ韶８５等ＡＬＶ－Ｊ

ＨＰＲＳ

’５７

ｇｐ８５、ＩＭＣｇｐ８５豹弱滚牲努褥

ｍｅｇＣｌｕｓｔａｌ

Ｔａｂｌｅ１

ＰａｉｒＤｉｓｔａｎｃｅｓｏｆ

ｔｈｅ锨蛔嘲珞ＡＬＶ－Ｊ舻８５一ｌｉｋｅａｎｄＡＬＶ－Ｊ

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图３内源性类ＡＬＷＪ朋８５与ＡＬＶ—Ｊ

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ｇｐ８５、ＩＭＣｇｐ８５氨基酸的比较

Ｆｉｇｕｒｅ３

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图４内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５与ＡＬＶ－Ｊ

ＨＰＲＳ

ｇｐ８５、ＩＭＣｇｐ８５抗原表位优势分析

Ｆｉｇｕｒｅ

４

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５８ 病毒学报２１卷

ＡＤＯＬＬｉｒｅ０

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Ｃｈｉｃｋｅｎ，ｋｉｎｅ２１ＳＪＦＥＡＶ—ＨＰ２

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Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ

ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ（×１００）

图５

内源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５与ＥＡＶ－ＨＰ的生物进化树分析

Ｆｉｇｕｒｅ５

Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ

ｔｒｅｅ

ｏｆｔｈｅ

ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓⅪｊＮ一１

ｇｐ８５一ｌｉｋｅａｎｄＥＡＶ－ＨＰ

ＣＤＳ编码ｇａｇ—ｅｎｖ融合蛋白。根据ｇａｇ－ｅｎｖ基因的

讨

论

缺失情况不同，有人将这些获得的ＥＡＶ—ＨＰ分为四个类型：Ｉ（原型是ＥＡＶ—ＨＰｌ）、Ⅱ（原型是ｅｖ／Ｊ

内源性类ＡＬＶ—Ｊ

ｇｐ８５

ＰＣＲ扩增、克隆和ＤＮＡ

ｃｌｏｎｅ３Ａ）、Ⅲ（原型是ｅｖ／Ｊ

ｃｌｏｎｅ

１Ｃ）和Ⅳ（ＥＶ刀

测序的结果表明，鸡的基因组中存在高度同源的内ｃｌｏｎｅ

４—１）。其中ｅｖ／Ｊｃｌｏｎｅ４—１具有完整的ｅｎｖ基

源性类ｇｐ８５完整序列。无论是ＡＡ肉鸡和ＳＰＦ蛋因。从鸡的进化角度考虑，对家禽的原鸡ＲＪＦ和鸡，还是由０系来航鸡（ＡＤＯＬ研究所培育）鸡胚成ＳＪＦ进行ＥＡＶ—ＨＰ的ＰＣＲ和杂交分析，可以得到阳纤维细胞发展而来的ＤＦｌ传代细胞，其基因组性结果，而在火鸡、鸭、家鸭和鹌鹑等其它禽类基因ＤＮＡ均可被外源性ＡＬｖ—Ｊｇｐ８５两侧的引物所扩组中没有找到ＥＡＶ—ＨＰ的证据。因此ＥＡＶ—ＨＰ仅增。由于没有可靠的无外源性ＡＬＶ感染的动物来存在于Ｇａｌｌｕｓ属。

源，本次实验中对实验鸡特别是待选肉鸡进行了较本研究中从ＳＰＦ白来航鸡中克隆的类ＡＬＶ－Ｊ

为详尽的预备实验，以保证实验数据的可靠性。经ｇｐ８５基因与ＭＴＣｇｐ８５一ｌｉｋｅ和ＤＦｌｇｐ８５一ｌｉｋｅ有所过ＡＬＶ—Ｊ的抗体检测和细胞接种实验、特异性ＰＣＲ不同，其个别碱基替换和在ｖｒ３区附近有３０个碱基扩增实验证实，所获得的内源性类ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因的缺失而形成差别。ＢａｍＨＩ酶切位点的产生是由序列的数据真实可靠。

于Ｔ替换Ｃ的结果。进化树分析中ＷＬＣｇｐ８５一ｌｉｋｅＤＮＡ的同源性分析表明，这些内源性序列与也处于已发表的ＥＡＶ—ＨＰ同源性的边缘。由于缺ＩＭＣｌ０２００株和原型株ＨＰＲＳｌ０３ＡＬＶ—Ｊ高度同源乏其它实验数据，还不能肯定它是另外一种内源性（９５．６％～９９．９％），与其它外源性ＡＬＶ－Ｊ毒株的病毒序列。针对这一克隆基因利用Ｂａｃ—ｔｏ－Ｂａｃ表达ＤＮＡ同源性比较得到相一致的结果。将这３个样系统（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）进行的尝试性表达（实验结果未展品ＤＮＡＰＣＲ扩增物与已发表的内源性病毒ＥＡＶ—示），在Ｓｆ９细胞中没有得到预想的抗原性蛋白的表ＨＰ序列进行比较，其结果的高度一致性说明这些达结果。或许与表达的抗原特性有关。当然，对内（有些或许是同一基因座）序列高度保守。相反，外源性类ＡＬＶ－Ｊｇｐ８５的尝试性表达实验还不完善，源性ＡＬＶ—Ｊｇｐ８５基因却有较高的变异性。这或许有待于补充和扩展。

与外源性病毒在宿主中受到的免疫压力和ｐｏｌ基因

内源性病毒ＦＡＶ—ＨＰ的存在使ＰＣＲ诊断技术

编码的聚合酶低精确性转录有关。尽管对这种与Ｊ

的应用面临更加严格的引物选择。既然Ｈ５小７和

亚群ＡＬＶ高度同源的内源性病毒知之甚少，然而实验中采用的ＰＣＲ反应Ｉ引物不能扩增任何非感

从实验肉鸡２０系、２１系和实验蛋鸡０系、Ｎ系、ＢｒＬ

染细胞基因组，说明这些引物用于ＰＣＲ诊断是Ｊ亚

Ｂｒｏｗｎ

ｌｅｇｈ０１ＴＩ，ＢｒＬ）系来航鸡以及对Ｆ（ＲｅｄＪｕｎｇｌｅ

群ＡＬＶ所特异的。事实上，ＥＡＶ－ＨＰ的发现是在ｆｏｗｌ，埘Ｆ）、ＳＪＦ（Ｓｏｎｎｅｒａｔ’Ｓ

ｊｕｎｇｌｅｆｏｗｌ，ＳＪＦ）ｕ¨获

用Ｈ３／Ｈ４引物扩增ＨＰＲＳ－１０３的ｅｎｖ序列时，可以得的ＥＡＶ—ＨＰ前病毒序列来看，ＥＡＶ—ＨＰｐｏｌ基因从感染和非感染鸡胚的成纤维细胞中扩增出同样大完全缺失，ｇａｇ和ｅｎｖ基因有程度不同的短缺。其

小的ＰＣＲ产物而获取信息。在ＥＡＶ—ＨＰ发现以