铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输

上传者：葛延津
|
上传时间：2015-04-22
|
密次下载

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输作者：沈宏等

论文

《中国科学》杂志社

SCIENCE IN CHINA PRESS

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输

沈宏, 侯凌艳, SCHLICHT Markus, WAN Ying Lang, MANCUSO Stefano,

②

BALUSKA Frantisek

① 华南农业大学资源环境学院, 广州 510642;

② Institute of Cellular and Molecular Botany, University of Bonn, Bonn D-53115, Germany;

③ Electrophysiology Laboratory, Department of Horticulture, University of Florence, Florence I-50019, Italy E-mail: hshen@http://wendang.chazidian.com 2008-03-20收稿, 2008-05-21接受

国家自然科学基金(批准号: 30771294, 30471040)、国际科学基金(批准号: C/3042-1, 2)和DAAD(批准号: Ref423)资助项目

①

②

③

摘要铝对植物毒害作用最明显的症状是迅速抑制根尖生长. 然而, 铝抑制根尖生长的机制并不清楚. 本文研究了铝对生长素和生长素运输载体(PIN2)囊泡运输的影响. 结果表明, 铝抑制拟南芥根尖生长素运输, 其中过渡区生长素抑制率最高, 达66%. 布雷菲尔德菌素(Brefeldin A, BFA, 一种囊泡运输抑制剂)明显诱导PIN2囊泡在细胞内形成点状结构, 铝处理降低点状结构的大小, 表明铝抑制PIN2囊泡在细胞内的运输. 实时定量PCR和蛋白印迹反应发现, 铝增加PIN2基因的转录表达, 促进PIN2蛋白在细胞膜水平方向累积. 细胞骨架解聚药物处理表明, 铝抑制PIN2囊泡的运输, 主要通过破坏肌球蛋白微丝来完成. 铝处理下, 拟南芥根尖伸长区细胞比过渡区具有较少的铝吸收和较低的囊泡运输频率. 上述结果表明, 通过调节生长素运输载体(PIN2)在质膜与胞内移动, 阻碍生长素的运输, 铝抑制了拟南芥根尖的生长.

关键词铝处理 PIN2 拟南芥细胞骨架生长素运输

铝毒是酸性红壤上影响作物生长最重要的限制因素之一, 其对植物的最初效应是抑制根系生长. 一直以来, 根尖被认为是铝毒害的主要部位. 根尖在感知重力和铝信号传递过程中起了重要作用[1]. Hou等人[2]和Baluska等人[3]利用细胞骨架去稳定剂(Latrunculin)破坏根尖肌动蛋白微丝, 导致了根尖向地性增强, 表明根尖细胞肌动蛋白微丝参与了根向地性信号传递的调节过程. 近来研究表明, 根尖过渡区是根系感受铝胁迫最敏感的部位; 局部施铝显著抑制根尖过渡区的生长[4~6]. 然而铝抑制过渡区生长的原因并不清楚.

PIN基因是生长素最重要输出载体, 原位可视化研究表明, PIN蛋白的极性定位指导了生长素极性运输和非对称分布[7~9]. 在拟南芥和玉米上, PIN蛋白能迅速完成质膜与胞内分室之间的囊泡运输[10]. 光照对生长素输出载体PIN2在细胞内分布起了决定性作

http://wendang.chazidian.com http://wendang.chazidian.com

用[11]. 铝减少高尔基体的分泌作用, 导致维管束细胞重组, 诱导细胞骨架发生变化[12~14]. 目前, 并不清楚铝对PIN转录翻译及其在细胞内分布的影响. 因此, 本项研究将借助共聚焦激光显微镜, 明确铝对PIN2蛋白及生长素运输的影响, 为阐明铝抑制根尖生长的分子基础提供证据; 研究结果对定向选育耐铝毒的作物品种具有指导意义.

1 材料和方法

(ⅰ) 材料培育. 拟南芥转基因材料包括生长素输出载体(PIN2::GFP)、肌动蛋白微丝(fimbrin actin- binding domain 2, ABD2::GFP)、微管蛋白(MAP4:: GFP), 来源于俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC Ohio State University)和波恩大学细胞与分子植物研究所(Institute of Cellular and Molecular Botany, University of Bonn). 拟南芥种子转入灭菌的离心管中, 用75%

1785

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输作者：沈宏等

内容需要下载文档才能查看

2008年8月第53卷第15期

乙醇消毒2 min, 然后用10%次氯酸钠溶液浸泡5 min, 再用无菌水清洗3次. 在超净工作台中用灭菌的牙签将种子均匀播在1/6 MS培养基上, 培养基pH 5.8, 1%葡萄糖. 播种完毕后, 将培养皿垂直放在光照培养箱中生长, 光照/黑暗时间分别为14 h/10 h, 生长6 d后, 用于不同处理. 所有试剂购于Sigma公司(St. Louis, MO, USA). BFA (brefeldin A), Latrunculin B, Oryzalin均溶于DMSO中, 先配成10 2 mol/L贮备液, 使用时稀释成工作液. 每个处理重复5次, 处理时间根据不同要求而定, 处理完毕后, 收获材料进行观察或进一步实验.

(ⅱ) 根系生长实验. 无菌条件下, 将拟南芥种子种植在固态MS培养基上, 生长6 d后, 选取大小一致幼苗转移到0, 100 µmol/L AlCl3溶液中处理10 min, 然后将幼苗转移到含有0, 100 µmol/L AlCl3处理的培养基上, 用毛笔尖将中性红标计在根尖不同位置, 每1 mm标计一下, 然后放在光照培养箱中生长24 h, 用尺子测量, 计算拟南芥不同根段的生长量.

(ⅲ) 根尖生长素运输的原位观察. 拟南芥幼苗在固态培养基上生长6 d后, 分别转移到含有0, 50 µmol/L BFA或100 µmol/L AlCl3的浓度为0.2 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中处理2 h, 处理完毕后, 将幼苗放置于0, 50 µmol/L BFA, 100 µmol/L AlCl3培养基上, 然后用生长素选择微电极测定生长素在不同区域的浓度, 生长素选择微电极放在距根表2 µm处, 传感器振动频率为0.1 Hz, 通过与生长素参比电极相比, 测定根尖生长素浓度, 具体方法参照文献[15].

(ⅳ) 激光共聚焦显微观察. 拟南芥转基因材料在MS培养基上生长6 d后, 分别转移到含有20 µmol/L BFA, 100 µmol/L Al, 20 µmol/L Latrunculin或10 µmol/L Oryzalin的浓度为0.2 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中处理2 h. 处理完毕后, 拟南芥幼苗放置在载玻片上, 在载璃片加1滴处理溶液, 盖上盖玻片, 放在激光共聚焦显微镜下观察. 观察过程中, 所有样品的显微镜与激光条件保持一致. 为防止样品因观察时间过长(超过2 min)而脱水, 观察过程中应加相同处理溶液. 每个处理植株观察量均为10株以上, 获取典型图片. 根尖铝累积通过间接荧光方法测定, 铝在根尖的累积与Morin荧光物质强度呈正比, 荧光越亮, 铝累积越多, 具体方法参考文献[16]. 激光共聚焦显微镜为Eclipse 800 (Nikon, Tokyo, Japan), 配

备有Argon激光(488 nm, 绿色; He, Ne激光为543 nm, 1.4 mW; 红色的二极管激光为638 nm, 5 mW), 用于自荧光检测.

(ⅴ) RNA提取及RT-PCR. 拟南芥幼苗在培养基上生长6 d后, 取整齐一致的幼苗放置含有0, 20 µmol/L BFA, 100 µmol/L AlCl3或20 µmol/L BFA + 100 µmol/L AlCl3的浓度为0.2 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中处理2 h. 处理完毕后, 用Trizol提取根系总RNA, 然后按Invitrogen 公司说明书进行实时定量RT-PCR. PIN2基因正向引物为5′-TAT CAA CAC TGC CTA ACA CG-3′, 反向引物为5′-GAA GAG ATC ATT GAT GAG GC-3′. β-tubulin作为内参(At5g12250). β-tubulin的正向和反向引物分别为5′-TGG GAA CTC TGC TCA TAT CT-3′和5′-GAA AGG AAT GAG GTT CAC TG-3′.

(ⅵ) 蛋白印迹反应. 拟南芥幼苗在培养基上垂直生长6 d后, 然后将其转移到0, 20 µmol/L BFA, 100 µmol/L AlCl3或20 µmol/L BFA + 100 µmol/L AlCl3的浓度为0.2 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中处理2 h. 处理完毕后, 收获1 cm根尖, 采用相分离(phase-partitioning)方法分别提取根系质膜蛋白和囊泡蛋白, 质膜囊泡溶解在SDS-loading缓冲液, 含有0.125 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 10% (质量体积比) SDS, 10% (体积比)甘油, 0.2 mol/L 二硫苏糖醇(DTT), 0.002% (质量体积比) 溴酚兰, 5 mmol/L苯甲磺酰氟化物. 经过SDS-PAGE后, 转入去氟PVP膜片(0.2 µm)上, 然后进行杂交反应. 为鉴定和量化PIN蛋白, 将膜片与抗玉米多克隆抗体杂交. 抗血清溶液用Tris缓冲液 + Tween按1∶1000稀释使用, 二次抗体检测使用BCIP-NPT方法进行, 具体方法见文献[17].

(ⅶ) 统计分析. 水培实验设2~4个处理, 每个处理重复5~10次, 所有数据均采用Excel和SAS软件进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 铝对拟南芥根系生长的影响

拟南芥根系比较细小, 为调查其不同根段对铝胁迫的敏感性, 采用了如下方法: 拟南芥幼苗在培养基上生长6 d后, 取整齐一致的幼苗, 在含有0, 100 µmol/L AlCl3的浓度为0.2 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中处理10 min, 然后放置在含有0, 100 µmol/L AlCl3

1786

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输作者：沈宏等

论文

的培养基上, 用中性红标计不同根段, 密封培养皿, 垂直放在光照培养箱中生长24 h后, 用直尺测量不同根段的伸长量. 分析不同根段对铝的敏感性发现(图1), 铝明显降低拟南芥根系生长, 其中根尖0~1 mm区域对铝最为敏感, 其他根段(1~2, 2~3, 3~4 mm)之间对铝胁迫反应没有明显差异. Baluska等人[18]认为, 生长5~7 d的拟南芥, 根尖0.2~0.4 mm为其过渡区, 该区细胞分裂比较频繁. 在玉米上, Kollmeier等认[19]为根尖过渡区1~2 mm的区域对铝最为敏感. 在菜豆上, Rangel等人[5]也认为根尖1~2 mm的区域对铝最敏感.

图2 拟南芥根尖生长素浓度的实时观察

拟南芥根系在含有0, 100 µmol/L AlCl3, 50 µmol/L BFA的浓度为0.2 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中处理2 h, 然后放在培养基上, 用生长素选择电极测定不同根段生长素浓度, 数据为平均值±标准

差(n = 5)

图1 铝对拟南芥根尖不同根段生长的影响

数据为平均值±标准差(n = 10), 不同字母表示差异显著(P<0.05).

CK, Al分别表示0, 100 µmol/L Al处理

2.2 铝抑制生长素运输

由于生长素在根系伸长过程中具有重要作用, 为探讨铝抑制根尖伸长的机理, 借助生长素选择微电极, 研究了铝处理下根尖0~1.5 mm区域的生长素运输(图 2). 结果表明, 正常生长条件下, 生长素在根尖0.25 mm处浓度最高, 为 183 fmol·cm 2·s 1, 显著高于其他根段(0~0.125, 0.5~1.5 mm). 铝和BFA处理明显降低生长素浓度. 在根尖0.25 mm处, 铝和 BFA处理的生长素浓度分别仅为正常生长条件下的34.3%和25.1%. 铝处理显著降低拟南芥根尖0.125~0.5 mm处生长素的浓度(图 2). BFA处理对生长素的抑制效果大于铝处理. 在根尖0.5~1.5 mm处, 铝降低生长素浓度, 但降低幅度没有过渡区(0.1~0.4 mm)大.

2.3 铝抑制PIN2囊泡的循环

囊泡运输抑制剂布雷菲尔德菌素(BFA)对植物高

尔基体、内膜的分泌具有可逆反应[20,21]. BFA抑制细胞胞吐作用, 但不影响其内吞作用[22]. 为研究铝抑制生长素运输的机理, 利用BFA研究了铝对生长素输出载体(PIN2)囊泡运输的影响(图3). 结果发现, 20 µmol/L BFA处理能诱导PIN2在根尖过渡区细胞内形成明显的点状结构(图3(b)); 单独铝处理并不能诱导细胞内点状结构的形成(图3(c)); 但是, 铝预处理或铝+BFA处理能降低BFA诱导PIN2点状结构的大小(图3(d)和(e)). 并且随着铝处理时间延长或铝处理浓度增加, BFA诱导的点状结构变小. 而且BFA诱导的点状结构经过2 h铝溶液淋洗后, 点状结构消失(图3(f)). 有趣的是, 铝处理下, 位于细胞水平方向上质膜荧光强度加深, 即PIN2囊泡有累积趋势

内容需要下载文档才能查看

(

内容需要下载文档才能查看

图

内容需要下载文档才能查看

3(c)).

图3 拟南芥根尖PIN2的囊泡运输

(a) 对照; (b) 20 µmol/L BFA处理2 h; (c) 100 µmol/L Al处理2 h; (d) 100 µmol/L Al预处理1 h, 然后20 µmol/L BFA 处理2 h; (e) 100 µmol/L Al + 20 µmol/L BFA处理2 h; (f) 20 µmol/L BFA处理2 h,

然后100 µmol/L Al淋洗

内容需要下载文档才能查看

2 h.

内容需要下载文档才能查看

标尺示8 µm

1787

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输作者：沈宏等

2008年8月第53卷第15期

2.4 PIN2基因的转录、翻译变化

铝抑制PIN2蛋白在细胞内形成点状结构大小(图3), 为探讨其内在机理, 研究了铝和BFA对PIN2基因的转录影响. 图4表明, 铝处理增加PIN2的转录表达, 但BFA对铝处理或非铝处理下PIN2的转录表达不产生影响(图4). 图5结果表明, BFA降低PIN2囊泡蛋白在质膜上的分布, 增加其在核内体的分布; 相反, 铝处理增加PIN2囊泡蛋白在质膜上的分布, 并降低其在核内体中的分布(图5). 结合图4和5可以看出, 铝影响PIN2的转录、翻译变化, 但BFA仅影响PIN2囊泡蛋白在质膜与核内体之间的分配, 表明它们对PIN2囊泡蛋白的影响机理不同.

图5 拟南芥根尖PIN2囊泡蛋白在质膜(a)及核内体(b)的

分布

拟南芥幼苗在培养基上生长6 d, 挑选大小一致的幼苗转入不同处理(CK, 对照; BFA, 20 µmol/L BFA处理; Al, 100 µmol/L AlCl3处理; BFA + Al, 20 µmol/L BFA + 100 µmol/L AlCl3处理)溶液中生长2 h, 处理完毕后, 收获1 cm根尖

内容需要下载文档才能查看

按照相分离的方法

内容需要下载文档才能查看

, 提取质膜蛋白和核内体蛋白, 蛋白印迹分析. 数据为平均值±标准差(n = 5)

图4 拟南芥根尖PIN2基因转录表达

拟南芥幼苗在培养基上生长6 d, 挑选大小一致的幼苗转入不同处理(CK, 对照; BFA, 20 µmol/L BFA处理; Al, 100 µmol/L AlCl3处理; BFA + Al, 20 µmol/L BFA + 100 µmol/L AlCl3处理)溶液中生长2 h, 处理完毕后, 收获1 cm根尖, 提取RNA, 实时定量RT-

PCR, β-tubulin基因为内标; 数据为平均值±标准差(n = 5)

2.5 PIN2囊泡蛋白的运输

铝抑制PIN2囊泡蛋白在细胞内运输, 增加其在质膜上的累积(图5). 为探讨铝阻碍PIN2囊泡蛋白在胞内运输的机理, 借助细胞骨架解聚剂研究了PIN2囊泡蛋白沿细胞骨架的运输情况(图6). 图6(b)为BFA诱导PIN2囊泡形成清晰的点状结构. Latrunculin B(Lat), 一种肌动蛋白微丝解聚剂, 处理拟南芥根尖过渡区细胞2 h, 发现, Lat处理使BFA诱导形成的点状结构消失(图6(c)). 而Oryzalin, 一种微管蛋白解聚剂, 处理拟南芥根尖过渡区细胞发现, Oryzalin并不影响PIN2囊泡在细胞内形成的点状结构(图6(d)). 这表明, 破坏肌动蛋白微丝, 使BFA诱导PIN2囊泡的点状结构消失(图6(c)), 而破坏微管蛋白, 并不影响点状结构(图6(d)), 因此, PIN2囊泡在细胞内运输很

图6 细胞骨架解聚剂对PIN2囊泡在细胞内形成点状结

构的影响

拟南芥幼苗在培养基上生长6 d, 挑选大小一致的幼苗转入不同处理((a) 对照

内容需要下载文档才能查看

; (b) 20 µmol/L BFA

内容需要下载文档才能查看

处理; (c) 20 µmol/L BFA + 20 µmol/L Latrunculin处理; (d) 20 µmol/L BFA + 10 µmol/L Oryzalin处理)溶液中生长2 h, 处理完毕后, 取根尖过渡区细胞进行观察.

标尺示8 µm

1788

铝抑制拟南芥根尖PIN2循环和囊泡运输作者：沈宏等

论文

可能通过肌动蛋白微丝途径进行. 2.6 铝对拟南芥根尖细胞骨架的影响

Sivaguru等人[23]通过酶联免疫分析方法研究发现, 90 µmol/L AlCl3处理1 h能诱导玉米根尖过渡区细胞肌动蛋白微丝发生明显变化. 借助拟南芥肌动蛋白微丝(ABD2::GFP)和微管(MAP4::GFP)转基因材料, 研究了铝对细胞骨架的影响. 从图7可以看出, 100 µmol/L AlCl3处理2 h明显改变根尖过渡区细胞肌动蛋白微丝排列, 使肌动蛋白微丝排列无序化(图7(b)). 铝对细胞微管束也有一定影响, 铝处理后, 微管束之间排列偏向疏松(图7(d)). 相比之下, 微丝比微管对铝更敏感. 由于铝胁迫主要破坏细胞肌动蛋白微丝(图7), 且PIN2囊泡蛋白的胞内运输主要通过肌动蛋白微丝来完成(图6), 这表明铝抑制PIN2囊泡在细胞内分布,

内容需要下载文档才能查看

很可能通过破坏肌动蛋白微丝的途

内容需要下载文档才能查看

径来实现

内容需要下载文档才能查看

(morin)染色,

内容需要下载文档才能查看

研究了拟南芥根尖过渡区和伸长区细

内容需要下载文档才能查看

图8 拟南芥根尖过渡区和伸长区细胞PIN2囊泡运输

(a)和(b) 伸长区细胞; (c)和(d) 过渡区细胞. (a)~(c) 对照; (b)~(d) 20 µmol/L BFA处理. 拟南芥幼苗在培养基上生长6 d后, 挑选大小一致的幼苗在不同处理溶液中生长2 h, 处理完毕后, 取根尖细

胞进行观察. 标尺示8 µm