人源胶质瘤细胞株的建立及其生物学特性分析

·84·2015年2月第37卷第2期　ChinJOncol,February2015,Vol.37,No.2

·基础研究·

人源胶质瘤细胞株的建立及其生物学特性

分析

陈桂林　李炎炎　谢学顺　陈金明　吴庭枫　李学涛　王杭州　周幽心　杜子威

【摘要】　目的　建立新的胶质瘤细胞株,为肿瘤研究提供具备新特性的细胞工具。方法　临床

手术来源的胶质瘤组织进行培养传代,第10代后克隆建立细胞株(SHG139)。经免疫荧光细胞化学

技术检测蛋白表达,流式细胞术(FCM)分析细胞增殖和细胞周期,染色体核型分析SHG139细胞的生

物学特性。应用神经干细胞培养液(NSCM)培养SHG139细胞,使其转化成胶质瘤干细胞球

(SHG139s),并检测SHG139s细胞的干性标志物。诱导分化SHG139s细胞后,检测分化细胞的胶质前体神经节苷脂(A2B5)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-Ⅲtubulin和半乳糖神经酰胺(GalC)的表达

情况,进一步比较SHG139和SHG139s细胞颅内原位移植瘤的病理特征。结果　成功建立的SHG139

第20代和第60代细胞A2B5、GalC、GFAP、酸性钙结合蛋白(S-100)和vimentin表达均为阳性,与肿瘤

组织的免疫组化结果及病理特征一致。SHG139细胞传代后24h内增殖显著,染色体总数为68条,

多倍体较多。SHG139s细胞中A2B5、巢蛋白(nestin)和神经元-神经胶质2型抗原(NG2)阳性比例分

别为(84.12±9.96)%、(73.86±5.01)%和(73.37±2.09)%。SHG139s细胞诱导分化后,贴壁细胞

中GFAP、β-Ⅲtubulin和GalC的阳性比例分别为(92.89±2.24)%、(64.85±4.09)%和(33.57±

4.14)%。SHG139s细胞颅内移植瘤呈胶质肉瘤和星形-少枝胶质细胞瘤的多种形态,肿瘤血管和瘤

SHG139s为A2B5+CD133-亚群细胞,具有自我更新和多向分化潜能。与SHG139细胞颅内移植瘤比

较,SHG139s细胞颅内移植瘤具有更强的恶性度和侵袭性。

【主题词】　神经胶质瘤;　干细胞;　细胞移植;　CD133;　胶质前体神经节苷脂;　小鼠,裸

Establishmentofanewhumangliomacelllineandanalysisofitsbiologicalcharacteristics　ChenGuilin?,LiYanyan,XieXueshun,ChenJinming,WuTingfeng,LiXuetao,WangHangzhou,ZhouYouxin,DuZiwei.?Neurosurgery&BrainandNerveResearchLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,ChinaCorrespondingauthor:ZhouYouxin,Email:zhouyxyq2008@http://wendang.chazidian.com周血管以鼠源性为主。结论　SHG139为星形胶质瘤细胞株,NSCM培养可成功获得SHG139s。【Abstract】　Objective　Toestablishanewgliomacelllineandanalyzeitsbiologicalcharacteristics,andtoprovideausefulcellulartoolwithnewfeaturesforcancerresearch.Methods　Gliomatissuewastakenfromsurgicalspecimenclinicalofaclinicalpatient.Primaryculturewascarriedout,andacellline(SHG139)wasestablishedafter10passages.Immunofluorescencestainingwasperformedtodetecttheexpressionofproteins,andcellproliferationandcycleweredetectedbyflowcytometrymethod(FCM).ThebiologicalcharacteristicsofSHG139cellsweredetectedbychromosomekaryotypeanalysis.SHG139sgliomacellsderivedfromSHG139gliomacelllinewereculturedwithneuralstemcellmedium.Thenstemcellmarkersweredetermined.SHG139scellswereinducedwithserum-containingmedium,andtheirexpressionofA2B5,GFAP,β-Ⅲtubulin,andGalCwasdetected.IntracranialxenografttumorofbothSHG139gliomacellsandSHG139sgliomastemcellsphereswasgeneratedinrats.Results　TheexpressionsofA2B5,GalC,GFAP,S-100,andvimentininthe20and60passagesofSHG139cellswerepositive,consistentwiththeimmunohistochemicalresultsandpathologicalfeatures.SHG139cellsproliferatedsignificantlywithin24haftersubculture,andtheirtotalnumberofchromosomeswas68andmostlymultiploid.TheywerepositiveforA2B5(84.12±9.96)%,nestin(73.86±5.01)%,andNG2(73.37±2.09)%.SHG139scellsinduced,andtheratioofpositivecellsofGFAP,β-ⅢtubulinandGalCwas(92.89±2.24)%,

DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2015.02.002基金项目:国家自然科学基金(NSFC81372689);江苏省卫生厅重点科研课题(K201106);江苏省“六大人才高峰”第九批高层次项目(WS-050)作者单位:215006苏州大学附属第一医院神经外科暨脑神经研究室

通信作者:周幽心,Email:zhouyxyq2008@http://wendang.chazidian.com

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(64.85±4.09)%and(33.57±4.14)%,respectively.Conclusions　SHG139isanastrogliomacellline,fromwhichSHG139scellscanbesuccessfullyobtainedbyculturewithNSCM.SHG139scellsareofA2B5+/CD133-GSCssubgroupcells,http://wendang.chazidian.comparedwiththeintracranialSHG139xenografttumor,theintracranialSHG139sxenografttumorismoremalignantandaggressive.

【Subjectwords】　Glioma;　Stemcells;　Celltransplantation;　CD133;　Glialprecursorsganglioside;　Mice,nude

　　随着对胶质瘤研究的深入,胶质瘤细胞的异质性特点越来越受到重视,这在某种程度上决定着胶质瘤个体化治疗的有效性。因此,建立不同特性的胶质瘤细胞株是深入研究胶质瘤的重要工具,对临床治疗有重要意义[1]。我院杜子威等[2]建立了我1640培养基20min。70μm过滤器过滤,红细胞裂解液裂解红细胞后,将5×105个细胞接种于含10%代,进行单细胞克隆纯化。

取第20代对数生长期的SHG139细胞,0.25%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养。传至第10

国第一株人脑胶质瘤细胞系SHG-44。近年来,我们在临床肿瘤组织中培养获得了一株新的胶质瘤细胞precursor,且转化(gliomaganglioside,成表达胶A2B5质前体神经节苷脂(glial和裸鼠颅内原位移植瘤的病理组织学特点进行了较stemcells,GSCs),)并就其分子生物学特性阳性的胶质瘤干细胞深入的研究,现将结果报告如下。

材料与方法

1.一、临床组织样本材料

在我科手术的1例23:胶质瘤组织标本来源于岁男性患者,诊断参照2010WHO年神经肿瘤标准[3]2.主要试剂和实验动物,建株后命名为:RPMISHG139。

F12、N2、纤维胎牛血清购自美国Hyclone公司1640、DMEM。碱性成/EGF)bFGF)细和胞表生皮长生因长子因(basic子(epidermalfibroblastgrowthgrowthfactor,factor,

自美购自美国InvitrogenMiltenyi国R&D公司。小鼠公司抗人。小鼠抗人CD133购A2B5自德购国购自美国BiotecAbnova公司公司。兔抗人神经巢蛋白。小鼠抗人CD34、兔抗人半(nestin)乳糖神经酰胺(galactocerebrosides,GalC)和小鼠抗

人神经元NG2)-神经胶质2型抗原(neuron-glialantigen2,CD34购isothiocyanate,FITC)一自抗美以国及Santa异Cruz公司。兔抗鼠CD31、鼠和羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公羊抗小鼠硫氰酸荧、羊抗兔光素、Cy3(fluoresceine羊抗小司。24只BalB/c裸鼠购自南京大学动物研究所。

1.二、组织标本的病理学检查及免疫组化实验方法

组织标本置于4%甲醛固定,石蜡包埋后进行切片:胶质瘤。分别行新鲜胶质瘤组织置于含2.HE肿瘤细胞原代培养及细胞增殖染色和免疫组化染色,显微镜下观察。

0.25%胰酶消化液的、周期检测RPMI

:

胰酶消化、重悬后,调节细胞浓度为1×107个/ml。加入羧基荧光素乙酰乙酸succinimidylester,CFSE)5(μl,carboxyfluorescein稀释至1×10diacetate6个/ml,接种于6孔板,1ml/孔。接种后24、48、72、96、120h镜下观察细胞生长SHG1393.胶养8h。细胞质瘤,流式细胞术检测细胞周期。

制成单细胞后加,培养细胞4株d后的,遗37℃加传100学低渗液ng分/析ml:取第20代10秋水仙素培30ml,孵育

后重悬min,(1∶3)染色。

固定细加入胞10,2再mlmin,加的冰醋酸-甲醇固定液(1∶3),离心离心去上清后滴片入10ml冰醋酸-甲,65℃醇固烤片后定液诱导分化4.SHG139:取第20细胞转化成胶质瘤干细胞的培养及代SHG139细胞,按1000个/孔的细胞密度接种于(NSCM,bFGF、1%内含N2),DMEM6孔板中,用神经干细胞培养基在37℃/F12、、5%20COng2/培养箱中培养mlEGF、20ng、/ml传代。镜下观察并记录细胞悬浮生长情况。转化的肿瘤干细胞命名为SHG139s。

NSCM二次球体形成实验重悬,调节细胞浓度至:SHG139s孔,记录单10细个细胞胰酶消化后胞/孔ml,位接种于置,置96

,

37℃孔培、5%养板CO,100μl/于

2培养箱中。每日镜下观察球体形成率,测量球体直径。将SHG139s细胞球置于含10%胎牛血清的化学检测5.SHG139DMEM:将SHG139和/SHG139sF12诱导分化培养液中培养或SHG139s细胞的免疫细胞荧光

。

细胞悬液滴于多聚左旋赖氨酸铺被载玻片上,4%多聚甲醛固定,细胞与一抗在湿盒中共同孵育,4℃过夜。磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline,PBS)冲洗,湿盒中细胞和二(bovine抗在室温避光条件下、1%牛血清白蛋基吲哚盐酸serum(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)albumin,BSA)中孵育1h。二脒基苯白孵育细胞1min,PBS洗后封片,分别在荧光、激光共聚

·86·2015年2月第37卷第2期　ChinJOncol,February2015,Vol.37,No.2焦和光学显微镜下观察分析。

105个/μl。将24只BalB/c裸鼠分为SHG139细胞

细胞脑内移植组,每组8只。皮下移植选择裸鼠右

106个,方法参见文献[4]。当荷瘤鼠出现恶病质

HE染色和免疫组化染色,分析颅内移植瘤模型是否建立成功。

结　　果

1.脑胶质瘤患者的临床影像学和病理资料:本腋,脑内移植接种于右侧大脑尾状核,接种细胞1×和SHG139s细胞消化、重悬后,调节细胞浓度为1×6.颅内移植瘤模型的建立:将培养的SHG139growthfactor,VEGF)及其受体(VEGFR)均为阳性,但肿瘤增殖抗原(Ki-67)阴性(图1)。2.人源胶质瘤细胞SHG139的原代培养及其表型特征:肿瘤组织原代细胞培养自第7代生长明显加快,胞体多呈梭形,双极细胞多见。传至第10代细胞行克隆,得到了已稳定传代至81代的SHG139细胞株。第20代SHG139细胞呈贴壁生长,胞核异型性大,可见圆形、多角形不规则的细胞,多数突起明显。免疫荧光染色显示,A2B5、GalC、GFAP、S-100、vimentin、VEGFR表达阳性(图2)。第60代SHG139细胞贴壁生长特性与第20代基本100、vimentin、VEGFR表达也为阳性(图3)。一致,免疫荧光染色显示,A2B5、GalC、GFAP、S-

3.人脑胶质瘤细胞SHG139的生长曲线:流式皮下移植组、SHG139细胞脑内移植组和SHG139s后,处死并完整取脑,甲醛固定。行石蜡包埋、切片、例脑肿瘤患者头颅MRI诊断为左额叶胶质瘤,术后

病理为纤维型星形细胞瘤。免疫组化显示,A2B5、

胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,

S-100)、血管内皮生长因子(vascular

endothelialGFAP)、酸性钙结合蛋白(acidcalciumbindingprotein,细胞仪检测显示,第20代SHG139细胞初始荧光强度值为669,24h后降为45.6,前4d降低趋势明显,4d后降低明显减弱(图4)。4.人源SHG139细胞的遗传学特征:第20代SHG139细胞经G显带染色体核型分析,其染色体

图1　人脑胶质瘤细胞SHG139的来源患者MRI影像及肿瘤标本病理分析　A:胶质瘤患者术前对比增强T1WI序列的

MRI;B:胶质瘤患者术前对比增强T2WI序列的MRI;C:肿瘤组织光镜下表现　HE染色　

血管内皮生长因子(++)和肿瘤增殖抗原(-)　免疫组化染色　×400组织胶质前体神经节苷脂(+++)、胶质纤维酸性蛋白(+++)、血管内皮生长因子受体(++)、酸性钙结合蛋白(+++)、×400;D~I:分别为胶质瘤

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图2　SHG139胶质瘤细胞的形态和肿瘤细胞标志物表达特点　A:人脑胶质瘤细胞原代培养至第7代贴壁细胞的形态　光镜　子受体(++)、胶质纤维酸性蛋白(-)、酸性钙结合蛋白(++)　免疫荧光染色　×

400×400;B~G:分别为第20代SHG139细胞胶质前体神经节苷脂(+++)、半乳糖神经酰胺(++)、vimentin(+++)、血管内皮生长因

图3　第60代SHG139细胞的肿瘤细胞标志物表达特征　免疫荧光染色　

F:酸性钙结合蛋白(++

+)×400　A:胶质前体神经节苷脂(+++);B:半乳糖神经酰胺(+++);C:vimentin(+++);D:血管内皮生长因子受体(+++);E:胶质纤维酸性蛋白(+++);

为六倍体,14号为八倍体(图

5)。

图5　第20代SHG139细胞染色体核型分析结果　Giemsa染

图4　第20代SHG139细胞的培养增殖曲线色　×1000　A:原核型图;B:排列核型图

总数为68条,呈不规则畸变。核型配对显示,染色

体16号缺失,7、12号为单体,1、2、4、5、8、10、11、

17、21、22号为双倍体,XY染色体正常,6、9、15号为三倍体,18号为四倍体,20号为五倍体,3、13、19号　　5.SHG139细胞转化成SHG139s细胞及其细1周后见干细胞样球体,悬浮生长。传至第10胞周期分析:第20代SHG139细胞在NSCM中培养代,可见大量SHG139s细胞悬浮生长(图6)。

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流式细胞检测显示,SHG139细胞的G1期、S期和1.54)%和(13.55±3.04)%,而SHG139s细胞的G2期细胞比例分别为(60.33±3.02)%、(25.33±G1期、S期和G2期细胞比例分别为(45.93±1.15)%、(26.32±2.46)%和(23.06±3.12)%。SHG139s细胞二次球体形成率为97.6%,培养21d后球体平均直径达到220μm。

6.SHG139s细胞的分子表型特点:取第10代

具有多向分化能力。

病理分析:SHG139细胞颅内原位移植瘤与其皮下移植瘤的细胞形态及核异型性相似,但SHG139细胞颅内原位移植瘤细胞密度更高,瘤内血管更丰富,SHG139细胞颅内原位移植瘤和皮下移植瘤的GFAP均阳性(图9)。SHG139s细胞颅内原位移植瘤呈浸润性生长,肿瘤细胞密度高,呈梭形、圆形,核异型明显,分裂象多见,瘤内可见“煎蛋样”结构的少枝胶质细胞瘤成分,部分区域可见微血管增生(图10)。其瘤内A2B5阳性细胞少,瘤周A2B5阳性细胞呈条索状,与主体肿瘤细胞无延续性,表明其具侵袭性。免疫组化显示,SHG139s细胞颅内原位移植瘤中CD133阴性,GFAP和S-100阳性,瘤内的星形胶质细胞瘤区域肿瘤细胞GFAP和S-100阳性,抗人血管特异性的CD34阳性,而抗鼠的CD31和CD34阳性细胞环绕肿瘤血管(图11)。

讨　　论

细胞培养作为肿瘤研究的最有力工具之一,至今已有60余年历史。人脑胶质瘤原代培养或胶质

8.SHG139细胞颅内原位移植瘤模型的建立与

SHG139s细胞进行免疫荧光细胞化学检测,结果见vimentin阳性比例分别为(73.86±5.01)%和(49.12±SHG139s为A2B5+CD133-GSCs亚群细胞

。

图7。其中CD133阳性比例为(4.20±1.29)%,

A2B5阳性比例为(84.12±9.96)%,nestin和12.83)%,NG2和异柠檬酸脱氢酶(IDH1R132H)阳性比例分别为(73.37±2.09)%和(36.77±13.19)%,表明　　7.SHG139s细胞的多向分化潜能:诱导分化

SHG139s细胞1d后,可见以干细胞球为中心向外

贴壁生长的大量细胞(图8)。1周后行细胞爬片,结果显示,贴壁细胞中GFAP、β-Ⅲtubulin和GalC的阳性比例分别为(92.89±2.24)%、(64.85±4.09)%和(33.57±4.14)%(图8),表明SHG139s细胞

图6　SHG139和SHG139s的细胞形态　SHG139s

细胞

×400　A:第10代SHG139细胞;B:第1代SHG139s细胞;C:第10代

图7　第10代SHG139s细胞肿瘤标志物的表达　免疫荧光染色　×400　A:CD133(-);B:胶质前体神经节苷脂(+++);

C:巢蛋白(+++);D:神经元-神经胶质2型抗原(+++);E:vimentin(++);F:异柠檬酸脱氢酶(++)