鱼油类保健品中不饱和脂肪酸的气相色谱及质谱检测研究

上海预防医学杂志&""#年第!)卷第(期

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?论著?

鱼油类保健品中不饱和脂肪酸的气相色谱及质谱检测研究

李波!，杨景贤!，韩丽!，郭德华!，熊丽蓓&

（上海出入境检验检疫局，上海&；上海市疾病预防控制中心，上海&）!*""!’(&*""’’)

摘要：［目的］研究鱼油中多不饱和脂肪酸含量的确证分析方法。［方法］利用毛细管气相色谱以及气质联用技术检测鱼油中多不饱和脂肪酸（如+的含量。［结果］建立了用毛细管色谱柱进行有效分离，保,-、./-、+/-）留时间定性，以面积归一法或外标法定量，以0同时对标准质谱库（4中没有的1$23法进行确证的有效方法，536库）成分（如+建立了标准谱图。［结论］本方法能满足对鱼油产品中不饱和脂肪酸的分析要求，具有简便、快/-、+,-）速、可靠的特点。

关键词：鱼油；不饱和脂肪酸；细管气相色谱；质谱

中图分类号：7)&’*)!文献标识码：-

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鱼油中含大量的多不饱和脂肪酸，包括./-、（二十二碳六烯酸）、（二十+,-和+/-等。+,-./-碳五烯酸）、（二十二碳五烯酸）和亚油酸、亚麻酸、+/-花生四烯酸一样，同属多不饱和脂肪酸（分子结构式中含有两个或两个以上双键的脂肪酸），但在结构上又有显著的不同。+,-、./-和+/-属"$’多不饱和脂

肪酸（分子结构式中第一个双键位于$177,基团反侧的第三个碳上），而亚油酸和花生四烯酸属"$)多不饱和脂肪酸（分子结构式中第一个双键位于$。+177,基团反侧的第六个碳上）,-和./-是鱼油$$特别是深海鱼油的特征脂肪酸，而+/-是海豹油的特征脂肪酸。陆地上的动植物体内几乎不含淡水鱼类中也只有极少数体内发现含有+,-和./-，微量的+,-和./-。而在海洋鱼类及甲壳类海产动物体内，特别是其脂肪中含有较丰富的+,-和./-。这些海产主要有：鲱鱼、鲇鱼、鲑鱼、金枪鱼、比目鱼、鲳鱼、沙丁鱼、鲭鱼、鳕鱼、墨鱼、磷虾以及我国沿海地区盛产的红三鱼、带鱼、池鱼、秋刀鱼、鲨鱼等。其脂肪中

鱼体的部位和捕+,-和./-的含量根据鱼的种类、

捞季节的不同而不同，并且这两种脂肪酸以三酰甘油的形式存在。"$’多不饱和脂肪酸对人体的保健作用已众所周知，但调查发现，鱼油产品质量悬殊较大，为了维护消费者的利益，规范鱼油制品的市场秩序，有必要建立其功效成分含量的检测方法。!材料与方法!*!仪器和试剂

气相色谱仪,（Q，气质联用仪/$)S%"5+）（,／）。氢氧化钠、甲醇、正己烷、氯化钠均/(S%"(%S%T为分析纯；三氟化硼（化学纯，；甲醇#U*"V$#U*UV）（）；／$三氟化硼’W!"*&@8DX氢氧化钠$甲醇溶液；标准品：纯度!+,-甲酯、./-甲酯、+/-甲酯，（!／%%V，’U种脂肪酸甲酯混合标准"@@XQ-2.L

，均为325Y）E@B公司产品。鱼油均为市售鱼油胶丸L和进口鱼油胶丸样品。

!*&色谱及质谱条件!*&*!色谱条件色谱柱：3,52-+ZR$/.0&"2型毛细管柱，载气：氢气，纯&(@["*&"@@["*&(@；#

作者简介：李波（，女，副主任技师，学士。!%)(!）

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上海预防医学杂志.%%,年第$=卷第-期，，QVW>59X69JHYF$=<Y"-

度!!流速$／；柱温：初始温度!"!!!#，"%&’&()保持$，以,／保$*%+，&()+&()的速度升温到$!-+，持$；进样口温度：进样方式：分流进样，分-&().$%+，流比-，进样量：检测器：%/$%"-’；012温度.,%+，!／，／，（<）-／3%&’&()4(5,%%&’&()6789:&’;.,.,。&()

接口温度：$".".质谱条件进样口温度：.=%+，离子源温度：四级杆温度：色谱.=%+，.-%+，$%%+；柱：，柱温：初始温度3>?-*%&@%".-&&@%".-&；!."$样品的衍生化

鱼油中的油脂，一般以饱和及不饱和脂肪酸的甘油酯酸形式存在，沸点很高，难于直接用气相色谱分析，需转化为挥发性衍生物，本方法是油脂皂化后再甲酯化，用正己烷提取后色谱测定。甲酯化的方法有

［］$／3重氮甲烷法和四甲基氢氧化铵法等，L0M3、*G*

本方法采用L／3试验证明在方法规定的条件0M3，*G*

下能使鱼油甲酯化完全。

［，］

.".皂化时间和温度的选择.*

%%+，保持$&()，以-+／&()的速度升温到$!%+，保持*&()，再以=+／&()的速度升温到.-%+，保持-&()；载气：氦气，纯度!!!"!!!#，流速%"A&’／()；质谱范围：*-",%%:；无分流进样，%"B-&()后打开分流阀。

"*方法步骤

称取鱼油样品%"$"%"*C（外标法时精确至%"%%$），置于.-&’具塞试管中，加*&’氢氧化钠?甲醇溶液，充满氮气于试管中，盖紧盖子，混匀，于=-+水浴加热.%&()，冷至室温，加入,&’甲醇?三氟化硼混合液，再充满氮气于试管，混匀，于=-+水浴加热&()，然后冷至室温，加入-&’经氯化钠饱和的正己烷，加盖振摇$&()，静置分层后，取上清液供色谱分析。

分别用正己烷稀释标准品成适当浓度，与样品处理液在相同色谱条件下进行测定，外标法测定时，以保留时间定性，以目标脂肪酸甲酯对应的色谱峰面积与标准品峰面积比较而定量。采用面积归一法定量时，须首先以标准品确定相应的保留时间，以目标脂肪酸甲酯对应的色谱峰面积与总色谱峰面积比较而定量。当样品色谱图中有干扰峰存在而不能正确定性时，则用气质联用仪加以确证。

外标法计算：

脂肪酸（&C／C）D（4E;

F@G@H@0）／（4EIJ@6）式中：4E;

F———样品中目标物的峰面积；4EIJ———标准品中目标物的峰面积；G———标准品中目标物的浓度（&C／&’）；H———有机相的体积（&’）；6———样品的取样质量（C）；0———脂肪酸与其酯的分子量比值，234?%"!-!$，K>4?%"!--B，2>4?%"!-!*

。面积归一化法计算：

脂肪酸（#）D（4(

@$%%@0）／4总式中：4(

———样品中目标物的峰面积；4总———样品中总的峰面积；0———脂肪酸与其酯的分子量比值，同上。结果与讨论

实验中的皂化温度和时间对结果的影响较大，温度低时间短，皂化不完全，结果偏低；温度过高时间长，

甲醇易挥发，也会影响甲酯化，因此选择温度=-+［,］

，对皂化时间进行条件试验，检测结果见表$（数据用面积归一法得出），由表$中可见当皂化时间太短，结果偏低，时间太长，K>4结果明显有所下降，本文最终选择皂化温度为=-+，时间为.%&()

。表$

皂化时间对结果的影响

皂化时间（&()）$%$-.%.-*%K>4?甲酯

（#）-"-!="$$="$,="$.-"AB2>4?甲酯（#）."-%."=%."=A."=!."=B234?甲酯

（#）-"$!

-",--"-.

-"-.

-"-*

."*充氮气保护的选择［-］

按方法规定的条件进行检测，一组在检测过程中

充氮气保护，另一组不充氮气保护，由表.（数据用面积归一法得出）可见，不充氮气的一组234、K>4和2>4结果明显偏低，

而且，谱图的峰型也较差。这是因为该类物质是多不饱和脂肪酸，其分子结构中有五六个双键，很容易受氧、光、热、金属元素及自由基的影响产生氧化、酸败、聚合、双键共轭化等化学反应，使结果偏低，因此本文选择使用氮气保护。

表.

氮气保护的影响

检测项目不充氮气充氮气234?甲酯

（#）B"!A"*K>4?甲酯（#）B"%B"*2>4?甲酯

（#）*".

*"A

.",色谱柱的选择我们曾采用3>?.%6（G4NLMO4P".%6>34QK）、3>?$%$（$!%!$R?%$.）、3>?1<<MO4P>KS"$!%!$<?$**）比较其分离效果，实验结果表明，Q31642TU?>KS.%6型毛细管柱（.-&@

%".%&&@%".-!&）在上述气相色谱条件下鱼油中的多不饱和脂肪酸甲酯之间的分离效果最好，234、K>4和2>4甲酯的气相色谱和气质联用仪上的保留时间分别列于表*

，气相色谱图见图$。$$&$C

-.（交联

上海预防医学杂志,&&*年第%)卷第.期，，6?@0ABCDBEFGH%)4G’.

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表!鱼油中几种不饱和脂肪酸甲酯在气相色谱和气质联

用仪上的保留时间（"）#$

不饱和脂肪酸甲酯亚油酸亚麻酸花生四烯酸/01201231

气相色谱%&’%()%%’,-%%*’)!!%.’+)&%(’+.*,&’)&.

气质联用%*’++%)’.+%(’+(,,’%&,(’)!!%’.,

图,鱼油的总离子流图

图!/01甲酯的质谱图

图%鱼油色谱图

,’.不饱和脂肪酸/01、201和231的质谱分析根据鱼油的总离子流图（图,）可得到保留时间为（图!），经4,,’%&"#$峰的质谱图567库检索为/01甲酯，同样可以定性其他峰。由于标准谱库中无231和2因此，我们用纯的标准品建立了其质01的谱图，谱图，存于谱库中，以供确认用。/01甲酯的分子量为!，，%)201甲酯的分子量为!**231甲酯的分子量为!。*,,’)/01、201和231的线性关系

以不同浓度的/01、201和231甲酯标准品进行色谱测定，其在一定测量范围内呈良好的线性关系（见表*）。

表.

序号（=）2319甲酯

（=）/019甲酯（=）2019甲酯

%%%’+%+’,%’(,

,%%’(%+’&%’+-!%%’)%+’!%’(!

表*

物质名称/019甲酯

2019甲酯2319甲酯

/01、201和231甲酯线性范围

浓度范围（）8&’%&&".’&&&’%&&".’&&&’%&&".’&&

回归方程

:;%)!’(+).<9.-’-.-:;+(’%!(,<9*)’*()&

相关系数&’(((+-&’(()+%

:;((’-*(+<9*+’(%,&%&’(()+.

,’-方法的精密度和准确度

对同一份鱼油样品平行检测)次，其结果见表.（数据用面积归一法得出），变异系数为%’&*="可见本方法具有较好的重复性。%’!)=，

对同一份样品，分别添加不同水平的231、/01和2回收试验结果见表)（数据由外标法01标准品，得出），回收率在-可见本方法的准确+’-="(+’*=，性能满足该类产品的分析要求。

精密度试验结果

*%,’&%-’(%’+(

.%%’+%+’*%’(*

)%%’-%+’%%’(&

平均值%%’+%+’,%’(%

标准偏差&’%*&’%(&’&,)

（=）>62%’%(%’&*%’!)

表)

检测项目/019甲酯

2019甲酯2319甲酯

样品本底值（"）8%!!!’*!*’&%)-’-,%.(’%%!’+&--’%&

!&’&&&’&&&’&&

%,’.,’.,’.

回收试验结果

）添加量（"8

,&’-.&’-.&’-.

!%’,.%’,.%’,.

%!!.’)!)’&%)(’+

）测得值（"8

,%.(’+%*’*.--’)(

!%’,!%’,%%’%)

%++’&+&’&+*’&

回收率（=）

,(!’!+)’--+’-!(+’*()’+(,’+

注：%为高浓度鱼油精；,为深海鱼油；!为葵花籽油

,’+外标法与面积归一法的结果比较面积归一法得出/01、201和231甲酯总量平均为%外标法平均为,经!检验两组数(’*=，&’!=，据间差异无显著性。用外标法计算时，只要进样量控制一致，相对准确，但必须考虑到标准品浓度的可靠性；用面积归一法计算时，结果相对偏低，但只要酯化

完全，色谱分离好，出峰比较完全，其结果也是可靠的。,’(气相色谱和气质联用的选择

［，］)-目前国家已有的该类标准方法中多为气相色谱法，因标准物质价贵、不宜获得和保存而使外标法和内标法受到限制，虽归一法检测的是目标化合物在组分中的相对含量，结果有所偏低，但试验证明只要甲酯

?%’3?

上海预防医学杂志%((3年第’/卷第4期，，#N8+F?I9?>ZGC’/!G&4

化完全、色谱分离度好，其误差也是在可接受范围的。所以一般情况下我们以气相色谱的面积归一法定量测定，但当样品色谱图中有干扰峰存在而不能正确定性时，则通过标准!用气"#$谱库和自建立的谱图检索，质联用仪加以确证测定。

表)

鱼油来源鳕鱼油鲱鱼油鲑鱼油鲭鱼油沙丁鱼油金枪鱼油鲑鱼油（高浓度）海豹油

%&’(实例

表)为实际样品检测结果（由面积归一法得出），此结果显示了不同鱼油品种和不同的加工提纯方式，其最终产品的不饱和脂肪酸的含量是不相同的，海豹油中的*+,含量较其他鱼油要高而成为其特征。

部分鱼油中多不饱和脂肪酸的含量（-）

!./多不饱和脂肪酸

亚油酸花生四烯酸(&3’&4’&0’&5%&4%&(’&%’&5

0&)(&)’&((&4’&)%&/’&4(&3

!.0多不饱和脂肪酸

".亚麻酸

(&%’&%(&6%&5(&5(&/(&)(&4

1+,’)&%)&(’5&%5&(’/&45&’00&0)&0

*2,0%&3/&5’’&56&3’(&%’)&6’5&45&0

*+,’&%(&6’&6’&%’&4’&00&30&5

1+,’))&(’55&(’/5&(0(

标识量*2,00)&(’%’(’(’5%(

*+,.......

!.0不饱和脂肪酸总量%(

本方法能满足对鱼油产品中不饱和脂肪酸的分析要求，具有简便、快速、可靠的特点，可推广应用于日常进出口鱼油类保健品的检测、市场监测和相关厂家作为气质联用确证方2,77+的控制监测等。同时，

法，可利用标准谱库的比对，而免去使用昂贵的标准品，由此降低检测成本，达到较好的经济和社会效益。

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［］&#

（收稿日期：）%((0.’’.’)

（上接第%’(页）

儿童肥胖的可行途径，具有更加深远的意义。

3参考文献：

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［］，，：HF?@>KUFGO’6/4HG’66/8&,FJN*LK7NLC>%(((50’5#%3&［］丁宗一&［8］)’65/#’66/年儿童期单纯肥胖症研究&中华儿科，

，：’6650/3(3#3()&

（收稿日期：）%((0.’%.%%

本研究结果显示，闵行区中小学生肥胖患病率总体上呈现男高、女低的特点，这与国内外其他的研究报

［，］4/道一致，其产生的机制目前仍不清楚。在本研究

中采用的两种评价方法均显示闵行青少年肥胖的患病率随年龄的增加呈现减低的特点，在’/岁时达到低谷，与国外青少年各年龄阶段肥胖患病率基本相仿或

［，］’%随年龄增加而增高的特点不同，其原因考虑除种

族差异外，饮食等环境因素可能起了重大作用。国外的研究表明，儿童青少年以及成年人群肥胖和超重患病率在逐渐升高的同时伴随着饮料和快餐食品摄入量

［］)的显著增加。闵行区中小学生肥胖的患病率呈现

出与国外不同的趋势是否是饮食习惯的差异所致，仍有待于进一步的病因学研究证实。

肥胖危害众多，但经国外的研究证实，综合运用饮食、运动、心理、行为和药物的多方位干预，肥胖是可以预防的。在本研究的基础上，继续研究探索适合于上海闵行区青少年肥胖儿童干预的有效方案，开辟干预