HPLC法测定市售蒺藜饮片中3种黄酮苷元的含量_张超

No．3药学研究·JournalofPharmaceuticalＲesearch2014Vol．33，·139·

HPLC法测定市售蒺藜饮片中3种黄酮苷元的含量

张

超

(山东中医药大学药学院，山东济南250355)

摘要：目的

建立高效液相色谱法同时测定蒺藜饮片中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法。方法

用

5μm)色谱柱，KromasilC18(4．6mm×250mm，甲醇－0．1%甲酸溶液(47∶53)为流动相，检测波长368nm，流速1.0mL·min－1，柱温25℃。结果1.73%。结论

0.292～14.6、0.248～12.4μg·mL－1槲皮素、山柰素和异鼠李素分别在0.58～29.0、

99.44%、99.20%，ＲSD分别为1.91%、1.85%、平均回收率分别为100.91%、范围内呈良好线性关系(r＞0.9997)，

该方法简便、快速、准确度高，可为蒺藜饮片的质量控制和炮制研究提供参考依据。

文献标识码：A

文章编号：2095－5375（2014）03－0139－003

关键词：蒺藜;槲皮素;山柰素;异鼠李素;高效液相色谱法中图分类号：Ｒ927．2

DOI:10.13506/j.cnki.jpr.2014.03.005

DeterminationofthreeflavonoidaglyconesinFructustribulibyHPLC

ZHANGChao

（ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China）

Abstract：Objective

ToestablishaHPLCmethodforthedeterminationofthecontentofquercetin，kaempferoland

KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm）columnwasusedtoanalyzethreefla-Thelinearityofeachstandardwasestablished

isorhamnetininFructustribuli.Methods

vonoidaglyconescontentwithmethanol－0.1%methanoicacidaqueoussolution（47∶53）asmobilephases.Theflowratewas1.0mL·min－1.Thedetectionwavelengthwassetat368nm.Ｒesults

intheconcentrationrangeof0.58～29.0μg·mL－1forquercetin，0.292～14.6μg·mL－1forkaempferol，0.248～12.4

－1

withcorrelationcoefficientr＞0.9997.Theaveragerecoveries（n=5）ofthreeflavonoidagly-μg·mLforisorhamnetin，

coneswas100.91%，99．46%，99．20%withtheＲSDof1．91%，1．85%，1．73%，respectively.Conclusionwasrapid，simpleandaccurate，whichcanbeusedinthequalitycontrolinFructustribuli.

Keywords：Fructustribuli；quercetin；kaempferol；isorhamnetin；HPLC

Themethod

蒺藜为蒺藜科植物蒺藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果实，具有平肝解郁，活血祛风，明目，止痒，《中国药典》2010年版的功效。历版药典均有收载

（一部）对蒺藜药材和饮片的质量控制仅有性状、鉴别、检查项，还未有相关指标成分的含量测定项。蒺藜主要含有甾体皂苷类、黄酮类、生物碱、多糖等化合物

，黄酮类主要是以槲皮素、山柰素、异其中，

鼠李素为苷元的黄酮苷类化合物，已有蒺藜药材水

［1］

奠定基础。

1仪器与试药1．1

仪器Agilent1100Series型高效液相色谱仪：G1312A二元泵、G1315B紫外检测器、G1316A柱温箱

（美国安捷伦科技公司）；KQ－250E型医用超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子分析天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）。1．2试药甲醇、乙腈均为色谱纯，水为高纯水，其他试剂为分析纯。槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为：100081－200406、110861－200405、110860－200406，供含量测定用）。所购5批蒺藜饮片经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为蒺藜科植物蒺藜TribulusterrestrisL.的干

［2，3］

，解产物黄酮苷元含量测定的相关报道但目前

市售蒺藜饮片多为炒制，还未见相关炒蒺藜中黄酮

苷元含量测定的报道。本研究建立了HPLC同时测定蒺藜饮片中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量的方法，为控制蒺藜炮制品的质量，探讨蒺藜的炮制意义

基金项目：中医药行业科研专项项目－20种中药饮片炮制技术规范研究（No．201207004－9）E－mail：zhangchaotcm@126．com作者简介：张超，男，博士研究生，副教授，研究方向：中药新药研究，

·140·No．3药学研究·JournalofPharmaceuticalＲesearch2014Vol．33，

燥成熟果实，分别取100g粉碎，过三号筛，备用。

2方法与结果2.1

色谱条件色谱柱：KromasilC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇－0.1%甲酸溶液（47

2.5

精密度试验吸取“2.4”项下一稀释混合对

－1

照品溶液（槲皮素2.32μg·mL，山柰素1.168μg

－1·mL－1，重复测定5异鼠李素0.992μg·mL），

∶53）；流速：1.0mL·min－1；柱温：25℃；检测波长

368nm；进样量20μL。槲皮素、山柰素和异鼠李素分离度良好，无其他杂质干扰，见图1

。

次，结果槲皮素、山柰素和异鼠李素的精密度均较好

（ＲSD分别为0.76%、0.73%和0.85%）。稳定性实验取同一蒺藜供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h测定，结果槲皮素、山柰素和异鼠李素在12h内的稳定性较好（ＲSD分别为1.04%、0.92%和1.21%）。2.7

重复性试验取5号样品粉末1.0g，精密称定，共5份，照“2．3”项下制备供试品溶液，按确定2.6

的含量测定方法测定槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，结果重复性好，变异系数小，符合含量测定要0.98%和1.35%）。求（ＲSD分别为1.29%、

2.8加样回收试验取已测定含量的5号样品约0.5g，精密称定，共5份，加入5mL槲皮素、山柰素和异鼠李素混合对照品溶液（分别精密称取槲皮素对照品2.17mg置10mL量瓶，山柰素对照品1.80mg置50mL量瓶，异鼠李素对照品2.00mg置50mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别

图1

HPLC色谱图

A．混合对照品；B．蒺藜饮片1．槲皮素；2．山柰素；3．异鼠李素

精密量取以上3种对照品溶液1.0mL稀释定容至同一50mL量瓶中，即得）。再精密加入甲醇－25%盐酸（4∶1）的混合溶液20mL，按确定方法测定，结果见表1～3。

表1

取样量（g）0.50730.50890.51450.47020.5624

槲皮素回收率试验结果

样品中槲皮素加入槲皮素测得量回收率平均回收ＲSD

（μg）（%）的含量（μg）的量（μg）率（%）（%）

21.2921.3621.5919.7323.60

表2

取样量

（g）0.50730.50890.51450.47020.5624

21.721.721.721.721.7

42.62

98.29

100.91

1.91

43.70102.9543.60101.4341.92102.2645.22

99.63

2.2对照品溶液制备分别精密称取槲皮素对照

品7.25mg，山柰素对照品3.65mg，异鼠李素对照品3.10mg，置同一50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。2.3

供试品溶液制备

取蒺藜样品1.0g，精密称

定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－25%盐酸（4∶1）的混合溶液25mL，密塞，称定重量，沸水浴中加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察分别精密量取混合对照品溶0.4、1.6、3.2mL，液0.1、置5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取以上稀释溶液和原混合对照品溶液各1.0mL，用甲醇稀释定容至5mL。各进样20μL测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果槲皮素在0.58～29.0μg·mL－1之间呈较好的线性关系（Y=219.55X+2.044，r=0.9997），山柰素在0.292～14.6μg·mL

－1

山柰素回收率试验结果

样品中山柰素加入山柰素测得量回收率平均回收ＲSD

（μg）（%）的含量（μg）的量（μg）率（%）（%）

3.653.663.703.394.05表3

3.63.63.63.63.6

7.267.217.386.947.56

100.2898.61102.2298.6197.50

99.44

1.85

异鼠李素回收率试验结果

ＲSD（%）

（μg）7.937.837.857.678.30

（%）100.5097.7597.25101.2599.25

99.20

1.73

率（%）

取样量样品中异鼠李加入异鼠李测得量回收率平均回收

之间呈较好的线性关系（Y=

（g）素的含量（μg）素的量（μg）0.50733.914.00.50890.51450.47020.5624

3.923.963.624.33

4.04.04.04.0

262.85X－1.638，r=0.9998），异鼠李素在0.248～12.4μg·mL－1之间呈较好的线性关系（Y=614.17X+3.103，r=0.9997）。

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2.9

样品含量测定分别取5批蒺藜样品1.0g

“2.3”各3份，精密称定，按项下供试品溶液制备方368nm），收波长分别为：槲皮素（256nm，山柰素

（265nm，366nm），370nm），异鼠李素（254nm，因此检测波长定为368nm。

在供试品溶液制备方法的研究中，曾比较甲醇和无水乙醇提取的差异，两者未见显著差异，还对沸水浴回流时间进行了考察，发现1h时黄酮苷元量已达平台。流动相选择仅对甲醇－0.1%甲酸溶液洗脱比例进行了调整以实现更好的分离效果。本研究所确定蒺藜饮片水解黄酮苷元HPLC测定方法，与传统总

［4］

黄酮UV测定法相比，简便易行，重现性、稳定性、准确度均较好，可用于蒺藜饮片的质量控制。

“2.1”法及项下色谱条件测定，并计算各样品中槲

皮素、山柰素和异鼠李素含量，结果见表4。

表4

样品12345

厂家

安徽沪谯中药饮片厂山东东营百草堂

中药饮片有限公司

蒺藜样品测定结果（n=3）

产地河南山东

山柰素异鼠李素槲皮素－1－1

（μg·g）（μg·g）（μg·g－1）41.6237.9231.4531.8041.97

7.416.776.606.557.20

6.476.196.767.077.70

济南建联中药有限公司

河北

中药饮片厂北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司聊城利民中药饮片有限公司

内蒙古山东

参考文献：

［1］李瑞海．中药蒺藜活性成分及质量评价研究［D］．沈

2006：10－14．阳：辽宁中医药大学，

［2］师勤，余伯阳．反相高效液相色谱法测定蒺藜类3种

．药物分析杂志，1999，19水解黄酮苷元的含量［J］（2）：75－78．

．实用［3］郝艳玲．HPLC法测定蒺藜中总黄酮的含量［J］

2006，9（5）：276－278．药物与临床，

［4］吴琼诗．蒺藜全草中总黄酮的含量测定［J］．广东药学

1998，14（4）：273－275．院学报，

3讨论

本研究所用5批蒺藜均为炒制品，是目前常用

炮制品，亦是常见的市售品。样品测定结果与文献均有不同程度下降，这是否与炒制相关，有待进一步确定。报道

安捷伦高效液相色谱仪二极管阵列检测器检测槲皮素、山柰素和异鼠李素对照品发现3者最大吸(上接第138页)

皂苷Ｒb1及三七皂苷Ｒ1的平均含量分别为15.88、16.30和4.82mg·g－1，峰面积的ＲSD分别为1.61%、0.50%、1.88%（n=6）。2.6.5

加样回收率试验取已知含量的样品约0.5g，共6份，精密称定，分别精密加入含人参皂苷Ｒg1三七皂苷Ｒ10.059mg·mL3种对照的混合甲醇

“2.2”溶液50mL，按项下方法处理得供试品溶液，分别进样测定，计算回收率。结果疏血通脉胶囊中

人参皂苷Ｒg1、人参皂苷Ｒb1及三七皂苷Ｒ1的平均98.90%回收率分别为100.40%（ＲSD=1.71%）、

（ＲSD=1.98%）和99.61%（ＲSD=1.69%）（n=6）。2.7

测定样品测定按上文拟订的含量测定方法，

了本品3批样品的含量，结果见表3。

表3批号人参皂苷Ｒg1

人参皂苷Ｒb1三七皂苷Ｒ1三种皂苷总含量

3批样品含量测定结果（mg·g2013030115.7816.284.7436.80

2013030216.2116.714.8937.81

－1

［2，3］

［《中国药典》2010年版（一部）［5］“三七”提取与含

量测定］项先溶剂浸泡过夜再加热回流提取两法比较，两法提取效果没有显著差异，而本文采用的方法更简便、快捷。3.2

本文建立的方法具有操作简便、灵敏度高、重复性好、测定准确等优点，能同时测定三七的3种主

－1

0.219mg·mL－1、人参皂苷Ｒb10.188mg·mL和

－1

要活性成分，可以作为疏血通脉胶囊重要的质量控

制指标之一。

参考文献：

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．辽宁中医杂志，2005，损伤神经细胞凋亡的影响［J］32（2）：89－91．

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IL－6和IL－8含性脑缺血再灌注后脑后织IL－1β、

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［3］刘泰，谭璐璐，秦若飞，等．醒脑通脉胶囊对局灶性脑

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［5］国家药典委员会．中华人民共和国药典2010年版（一

2010：11．S］．北京：中国医药科技出版社，部）［

）

平均含量16.0416.504.8237.36

2013030316.1416.504.8237.46

33.1

讨论

在提取条件比较时，采用本法直接加溶剂超声