藏红花(Crocus+sativus+L)的分子鉴定研究

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四夕Ｉ『大学

硕士学位论文、．作者主建完成日期！！！ｉ生！旦！！旦

培养单位生全盘鲎．堂堕指导教师廑盐割亟拯——专业撞堑堂

研究方向垫堑垒直垒堑堂鱼垒堑垫盔授位日期——一生旦旦

四川大学硕七学位论文

藏红花（ＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）

的分子鉴定研究

植物学专业

研究生：车建指导教师：唐琳副教授

摘要

藏红花（ＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ）系莺尾科番红花属多年生草本植物，又称番红花（本草纲目）、西红花，主产于欧州及中亚地区，我国有少量栽培，以进口为主。藏红花具有很强的活血化瘀和散郁开结的功效。近年的研究发现，藏红花具有良好的抗癌活性，而且几乎无毒副作用。其疗效可靠，货源稀少，价格昂贵，某些不法商贩制假售假，严重影响了药材质量及用药的安全性。市场上常见伪品及掺伪品有：菊科植物菊花（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ．ｃｈａｎｅｔｉｉ．）；莲须，系睡莲科植物莲（ＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ．）的干燥雄磊经染色而成；禾本科檀物玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）的须染色假冒藏红花；红花（ＧａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓＬ．）染色制作的伪品等。

为了更快速、准确的鉴别出藏红花的真伪，我们进行了以下研究：

１．比较研究藏红花与其易混物种ＩＴＳ序列的差异和规律．寻找藏红花的分子鉴定方法。

从正品藏红花以及番紫花两个园艺品种中提取总ＤＮＡ，用ＩＴＳ序列通用引物扩增，扩增产物克隆测序；莲须、菊花、玉米、红花的ＩＴＳ序列从ＧｅｎＢａｎｋ中抉得。首次测得并报道藏红花以及番紫花两个园艺品种的ＩＴＳ仝长序列，总长度分别为６５８ｂｐ、６３４ｂｐ和６３３ｂｐ，包括ＩＴＳｌ、５．８Ｓ和ＩＴＳ２区，ＧｅｎＢａｎｋ注Ｖ

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册登记号为ＤＱ０９４１８５、ＤＱ２２４３６３和ＤＱ２２４３６４。藏红花和番紫花两个园艺品种的ＩＴＳ序列相似性均高于９ｌ％；番紫花两个园艺品种之问ＩＴＳ序列的相似性高达９９．８４％。

比较ＩＴＳｌ区序列，正品藏红花与其易混中药材的差异性均在４６％以上；比较ＩＴＳ２区序列，正品藏红花与其易混中药材的差异性均在４ｌ％以上。

根据ＩＴＳ序列特征，能有效区分藏红花和其它易混中药材。ＩＴＳ序列是正品藏红花鉴定的有效的分子标记。

２．用ＩＳＳＲ标记对藏红花和藏红花８个近缘园艺品种进行了遗传分析，选取了与中药藏红花易混的菊花和玉米作为外类群，构建了包括１１个物种的ＤＮＡ指纹图谱，利用ＤＮＡ扩增结果对藏红花及其近缘园艺品种进行了聚类分析。通过不加权成对算术平均法（ＵＰＧＭＡ）分析，发现番紫花（Ｃｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ。ｗｈｉｔｅ）和藏红花园艺品种（Ｃｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ－ｄＥＡＮＮＥＤ■Ｒｃ）遗传关系相当接近，二者植株和花叶的形态也十分相似，应该属于同一物种；藏红花园艺品种ＣｒｏｃｕｓＣｈｒｙｓａｎｔｈｕｓ－ＡＤＶＡＮＣＥ、ＣｒｏｃｕｓＣｈｒｙｓａｎｔｈｕｓ．ＢＬＵＥＰＥＡＲＬ和ＣｒｏｃｕｓＣｈｒｙｓａｍｈｕｓ—ＦＵＳＣＯＴＩＮＣＴＵＳ显示了相近的遗传关系，同时也表现出了一定程度的分化。除此之外，藏红花及其园艺品种相互间的遗传分化比较明显，菊花和玉米作为外类群，也很清晰的表现在进化关系上。

可见，ＩＳＳＲ分子标记能够有效的区分亲缘关系较近的藏红花及其近缘园艺品种，其检测灵敏度高，亦即多态性水平高，操作简单易行，在构建品种特征图谱和真伪鉴定上，具有相当的潜力。

３．运用分子标记技术对各种药材进行鉴别时，能否从药材中提取到有效的ＤＮＡ是分子技术的关键。由于商品药材多数经过加工处理，ＤＮＡ会出现不同程度的降解；植物药材中丰富的多糖等次生物质，会影响ＤＮＡ的提取和ＰＣＲ的扩增；而药材贮存时间的长短，植物药材所属部位的不同，如花、叶类药材与根茎类药材，ＤＮＡ的提取方法也相应有所不同。针对藏红花药材的特点，尝试了多种ＤＮＡ提取方法，并对所提取到的ＤＮＡ作了ＰＣＲ扩增分析。

关键词；藏红花：ＤＮＡ；分子标记；ＩＴＳ；ＩＳＳＲ；分子鉴定ＶＩ

四川大学硕士学位论文

Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．

Ｍａｊｏｒ：Ｂｏｔａｎｙ

Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：ＣｈｅＪｉａｎＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＶｉｃｅＰｒｏｆ．ＴａｎｇＬｉｎ

Ａｂｓｔｒａｅｔ

Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕ￥Ｌ．ｉｓａｖａｌｕａｂｌｅｐｌａｎｔｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｆｏｒｍａｎｙ

ｎｏｔｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｉｔｓｓｔｉｇｍａｓｃｏｎｔａｉｎ

ｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｔｈａｔｃａｎｏｎｌｙｅｘｐｅｎｓｉｖｅｓｐｉｃｅａｎｄｐｉｇｍｅｎｔ，ｂｕｔａｌｓｏｗｉｔｈ１ｉｔｔｌｅｓｉｄｅ．ｅｆｆｅｅｔｓｆｒｏｍｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇａｉｎｓｔｃａｎｃｅｒ

ｒｅｓｅａｒｃｈ．１１１ｅｖｅｒｙｌｏｗｙｉｅｌｄｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．ａｎｄｓｔｒｉｃｔｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒｈａｂｉｔａｔｒｅｓｕｌｔｉｎｉｔｓｓｈｏｒｔａｇｅｆｏｒｍｅｄｉｃｉｎａｌｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｈｉ【ｇｈｐｒｉｃｅｉｎｔｈｅｍａｒｋｅｔ．ＳｏｍｅｉｎｉｑｕｉｔｙｂｕｓｉｎｅｓｓｍｅｎｐｒｏｄｕｃｅａｎｄｓｅｌｌｔｈｅｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．ｗｈｉｃｈａｆｆｅｃｔｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．ａｎｄｔｈｅｓａｆｅｔｙｏｆｕｓｉｎｇ．ＴｈｅｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｐｏｓｓｉｂｌｙｃｏｎｔａｉｎｓｏｍｅｔｈｉｎｇｆａｋｅｍａｄｅｏｆＺｅａｍａｙｓＬ．ａｎｄＣａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓＬ．，ｔｈｅｄｒｙａｎｄｒｏｅｃｉｕｍｏｆＮｅｌｕｍｂｏｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ．，Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉｉ．ｅｌａ１．

ｄｏｎｅｔｈｏｓｅｓｔｕｄｉｅｓｔｏＷｅ’ｖｅ

ｅｘａｃｔｌｙ：ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｔｈｅｔｒｅｅｓａｆｆｒｏｎｆｒｏｍｔｈｅｆａｋｅｆａｓｔａｎｄ

１．ＴｂｆｉｎｄｔｈｅｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｒＤＮＡＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．、

ｍａｙｓＬａｎｄＧａｒｔｈａｍｕｓＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉｉ．、Ｎｅｌｕｍｂｏ

ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓＬ．ａｎｄ

ｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓｔｏｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ．、Ｚｅａｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｄｏｔｈｅｓｅｆｏｌｌｏｗｉｏｂｓ．Ｌ．ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｓ，ｗｅ

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四川大学颂十学位论文

Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｏｍｌＤＮＡｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．、Ｃｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ－ｗａｎｄＣｍｃｕｓｖｅｒｎｕｓ－ｐｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ．Ｓｅｃｏｎｄｌｙ，ｔｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙｐｒｉｍｅｒｏｆＩＴＳＰＣＲ埘ｔｌｌｕｎｉｖｅｒｓａｌａｎｄｃｌｏｎｉｎｇ．１１１ｅａｎｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔＷａＳｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｈａｎｅｔｉｉ．、Ｎｅｌｕｍｂｏ

ａｎｄＧａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓＬｗｅｒｅｎｕｃｉｆｅｒａＧａｅｒｔｎ．、ＺｅａｍａｙｓＬｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋ．Ｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅｗｅｇｏｔ

ｓａｔｉｖｕｓａｎｄｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣｒｏｃｕｓＬ．、Ｃｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ．ｗａｎｄ

Ｃｒｏｃｕｓｒｅｍｕｓ－ｐ，ｗｈｉｃｈｉｎｃｌｕｄｉｎｇＩＴＳｌｒＤＮＡ，５．８ＳｒＤＮＡ，ＩＴＳ２ｒＤＮＡ．ＴｈｅＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮＯ．ａｒｅ

ＩＴＳＤＱ０９４１８５、ＤＱ２２４３６３、ＤＱ２２４３６４．ｎｌｅｓａｔｉｖｕｓＬ．ａｎｄｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｙｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＣｒｏｃｕｓｔｗｏｇａｒｄｅｎｓｐｅｃｉｅｓｏｆＣｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓｉｓａｂｏｖｅ９１％：ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｔｙｉＳ９９．８４％ｂｅｔｗｅｅｎＣｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ—ｗａｎｄＣｒｏｃｕｓｖｅｒｎｕｓ－ｐ．１１１ｅｒａｎｇｅｏｆｄｉｖｅｒｓｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬａｎｄｏｔｈｅｒｈｅｒｂｓｗａｓａｂｏｖｅ４６％ｂａｓｅｄｏｎ

ｃａｎＩＴＳｌａｎｄａｂｏｖｅ４１％ｂａＳｅｄｏｎＩＴＳ２．Ｗｅｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ

ａｌｌＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬｆｒｏｍｉｔｓｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｂｙｔｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＴｈｅＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｉＳ

ｓａｔｉｖｕｓＬａｖａｌｌａｂｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｌ＂ｍａｒｋｅｒｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣｒｏｃｕｓ

２．Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ＷａＳｕｓｅｄｔＯｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ

Ｌ．ＥｌｅｖｅｎｖａｒｉａｔｉｏｎｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｕｓｈｉｐｓｉｎＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ

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