碳源_氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生物量和活性成分积累的影响_王娟

碳源、氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生物量和活性成分积累的影响

王娟1,2，高文远2*，曹宇2，黄滔2（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津科技大学中药生物工程研究所，天津 300457）

摘要：目的 研究碳源、氮源和磷源对西洋参悬浮细胞生长，人参皂苷Re，Rb1以及西洋参多糖合成的影响。方法 利用组织培养技术结合高效液相色谱法和紫外分光光度法，通过改变培养基碳源种类、氮源和磷源浓度，研究其对西洋参悬浮细胞生长，人参皂苷Re，Rb1以及西洋参多糖含量的影响。结果 添加40 g·L-1蔗糖的细胞干重生长率最大，加入30 g·L-1蔗糖得到的人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高，分别为0.531%，0.145%和3.62%。本实验保持氮源浓度60 mmol·L-1，当培养基中全部为NO3-时，细胞干重生长率最低，而人参皂苷Re、Rb1和多糖含量最高，分别为对照组的2.40，1.96和4.41倍。添加5.00 mmol·L-1的KH2PO4，细胞干重生长率最大。当培养基中KH2PO4浓度为0.63 mmol·L-1时，人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高。结论 本实验确定了西洋参细胞悬浮培养的最佳碳源种类、氮源比例和磷源浓度，表明不同碳源、氮源和磷源对西洋参细胞生长和活性成分有显著影响。

关键词：西洋参；碳源；氮源；磷源；人参皂苷；多糖

中图分类号：R282.2 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2009)11-0815-04

Effects of Carbon，Nitrogen and Phosphate Sources on Biomass and Active Components of Suspension Cells in Panax quinquefolium L.

WANG Juan1,2，GAO Wen-yuan2*，CAO Yu2，HUANG Tao2（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2. Institute of Biological Engineering of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

ABSTRACT：OBJECTIVE To study the effects of carbon, nitrogen and phosphate sources on the growth of Panax quinquefolium suspension cells and the synthesis of ginsenosides Re, Rb1 and polysaccharide.METHODS The suspension cells were obtained through tissue culture by manipulation of carbon, nitrogen and phosphate sources. The contents of ginsenosides Re and Rb1 were determined by HPLC while the contents of polysaccharide were determined by ultraviolet spectrophotometry. RESULTS The maximum growth rate of suspension cells of P.quinquefolium was achieved with the addition of sucrose at level of 40 g·L-1. The maximum contents of ginsenosides Re, Rb1 and polysaccharide were achieved with the addition of sucrose at level of 30 g·L-1, and the contents were 0.531%, 0.145% and 3.62%, respectively. In the case of NO3- as the sole N source, the cell growth rate was lowest when the concentration of total nitrogen source was kept at 60 mmol·L-1. The maximum contents of ginsenosides Re, Rb1 and polysaccharide were increased by 2.40, 1.96 and 4.41-fold compared with those of control, respectively. The maximum growth rate was achieved at 5.00 mmol·L-1 KH2PO4 concentration. The maximum contents of ginsenosides Re, Rb1 and polysaccharide were achieved at 0.63 mmol·L-1 KH2PO4.CONCLUSION The results show that various carbon, nitrogen, and phosphate sources have the significant effects on suspension cells growth of P.quinquefolium and active components. The sources of carbon, nitrogen and phosphate for the suspension cells culture of P.quinquefolium were optimized.

KEY WORDS：Panax quinquefolium L；carbon;nitrogen；phosphate；ginsenoside；polysaccharide

西洋参（Panax quinquefolium L）又称美国人

参。原产于美国东部和加拿大，是五加科人参属植

物。现代研究发现，西洋参能促进血液循环，降低

血糖，并且有一定的抗癌、抗衰老作用。由于西洋

参的医疗和保健用途不断扩大，因而供不应求，价

格昂贵。为了减轻资源压力，人们正探索采用生物

技术的方法来解决部分资源。国内外学者对于西洋

参细胞生产次生代谢产物的研究有一些报道[1-2]，但

基金项目：国家科技支撑计划资助项目(2006BAI06A16-02) 是关于西洋参细胞培养中多糖含量的报道比较少[3]。本实验在西洋参悬浮细胞培养成功的基础上，进行了几种培养基成分对西洋参细胞生长，人参皂苷和西洋参多糖合成的影响研究。 1 材料与方法 1.1 材料 供试材料为在附加2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）

作者简介：王娟，女，硕士研究生 研究方向：中药生物工程 *通讯作者：高文远，男，研究员 研究方向：中药生物工程 Tel/Fax：（022）87401895 E-mail：pharmgao@http://wendang.chazidian.com

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1 mg·L-1和激动素（kinetin，KT）0.25 mg·L-1的基本MS液体培养基中培养继代多次的西洋参细胞。人参皂苷Re标准品（批号110754-200421），人参皂苷Rb1标准品（批号110704-200420），葡萄糖标准品（批号110833?200302），均购自中国药品生物制品检定所。 1.2 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；HNY-82型摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；UV-2000紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。 1.3 方法

1.3.1 碳源对西洋参细胞培养的影响 将传代多次的西洋参细胞0.75 g接种到100 mL三角瓶中继代培养25 d，三角瓶内盛有30 mL附加1.0 mg·L-1 2，4-D和0.25 mg·L-1 KT的MS培养基，培养基中分别添加质量浓度为20，30，40 g·L-1的蔗糖、葡萄糖和果糖。培养基pH灭菌前为6.0，摇床转速为120 r·mim-1 ，每组重复处理3瓶。

1.3.2 氮源对西洋参细胞培养的影响 将传代多次的西洋参细胞0.75 g接种到100 mL三角瓶中继代培养25 d，三角瓶内盛有30 mL附加1.0 mg·L-1 2，4-D和0.25 mg·L-1 KT的MS培养基。保持总氮源浓度60 mmol·L-1不变，NH4+/NO3-浓度分别为0/60，7/53，12/48，20/40，30/30。培养基pH和摇床转速如上，每组重复处理3瓶。

1.3.3 磷源对西洋参细胞培养的影响 将传代多次的西洋参细胞0.75 g接种到100 mL三角瓶中继代培养25 d，三角瓶内盛有30 mL附加1.0 mg·L-1 2，4-D和0.25 mg·L-1 KT的MS培养基。其中KH2PO4浓度分别为0.31，0.63，1.25，2.50，5.00 mmol·L-1。培养基pH和摇床转速如“1.3.1”，每组重复处理3瓶。

1.3.4 西洋参细胞干重生长率测定 将收获的西洋参悬浮细胞置于烘箱中，在60 ℃下烘24 h，使其干燥至恒重，称其干重，并计算其干重生长率：干重生长率%=（收获细胞干重-接种细胞干重）/接种细胞干重×100%。

1.3.5 人参皂苷Re、Rb1含量测定方法 精密称取0.2 g左右干燥的西洋参细胞组培物置于50 mL具塞三角瓶中，加入20 mL正丁醇，静置过夜，超声2次，每次30 min，过滤，滤液浓缩至干，残渣用甲醇溶解并定容至1 mL量瓶中，用0.22 µm微孔滤膜过滤，得样品供试品溶液。

液相色谱条件：色谱柱为Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm，5 µm)；流动相A：乙腈，B：水；梯度洗脱程序：0→25 min，A：18%→49%；流速1.0 mL·min-1；检测波长203 nm；柱温40 ℃。 1.3.6 西洋参多糖含量测定方法 精密称取0.2 g左右干燥的西洋参细胞组培物加80%乙醇20 mL， 90 ℃水浴回流1 h，重复1次，趁热抽滤，滤渣用80%热乙醇洗涤。挥干溶剂后，滤渣连同滤纸置于烧杯中，加5 mL蒸馏水，100 ℃水浴浸提1 h，趁热过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，置于100 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。根据相关文献[4]，在480 nm波长条件下测定吸光度，根据回归方程A=0.005 4ρ+0.019 7，r=0.999 7，计算多糖含量。

1.3.7 统计分析 本实验所有数据均使用SPSS 11.5软件进行统计学处理，数据以±s表示。 2 结 果

2.1 碳源对西洋参细胞培养的影响

不同碳源对西洋参细胞生长及其有效成分含量的影响见表1。添加不同浓度的蔗糖、葡萄糖和果糖显著影响西洋参细胞的生长、人参皂苷Re以及多糖的含量。添加40 g·L-1蔗糖的细胞干重生长率最大，添加20 g·L-1葡萄糖的细胞干重生长率最低。加入30 g·L-1蔗糖得到的人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高，分别为0.531%，0.145%和3.62%。 2.2 氮源对西洋参细胞培养的影响

本实验采用MS基本培养基，保持氮源浓度60 mmol·L-1不变，改变NH4+和NO3-的比值，考察不同形式氮源对西洋参细胞生长和有效成分的影响，结果见表2。当培养基中全部为NO3-时，细胞干重细胞生长率最低，随着培养基中NH4+浓度的增加，干重生长率提高，当NH4+浓度为12~30 mmol·L-1，细胞生长变化不大。当培养基中仅为NO3-时，人参皂苷Re、Rb1和多糖含量最高，分别为对照组（NH4+/NO3-为20/40）的2.40，1.96和4.41倍。 2.3 磷源对西洋参细胞培养的影响

磷是植物器官生长的一个重要营养成分。较低浓度的KH2PO4(0.31 mmol·L-1)得到的细胞干重生长率以及有效成分含量最低，添加5.00 mmol·L-1的KH2PO4，细胞干重生长率最大。当培养基中KH2PO4浓度为0.63 mmol·L-1时人参皂苷Re，Rb1和多糖的含量最高，分别为0.401%，0.330%和5.38%。KH2PO4浓度低于或高于0.63 mmol·L-1时人参皂苷和西洋参多糖含量均降低。见表3。

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表1 不同碳源对西洋参细胞影响.n=3，±s

Tab.1 Effects of carbon sources on suspension cell of P.quinquefolium L. n=3，±s

Carbon sources Sucrose/g·L

-1

Consistency/g·L-1 Dry weight growth rate

1)

Ginsenoside Re/ % Ginsenoside Rb1/% Polysaccharide/%

20 6.60±0.08 0.249±0.001 0.069±0.001 2.23±0.18

30 9.16±0.40 0.531±0.012 0.145±0.004 3.62±0.35 40 11.32±0.001) 0.207±0.0071) 0.040±0.001 1.42±0.251)

Glucose/g·L

-1

20 5.64±0.081) 0.033±0.0031) 0.104±0.006 1.45±0.141)

30 7.48±0.001) 0.242±0.0191) 0.072±0.007 2.04±0.02 40 9.48±0.24 0.348±0.011 0.107±0.005 2.30±0.19

Fructose/g·L

-1

20 6.52±0.001) 0.503±0.004 30 8.44±0.161) 0.365±0.002 40 10.04±0.001) 0.486±0.003

0.093±0.004 1.74±0.241) 0.080±0.002 2.00±0.001)

0.137±0.010 2.31±0.12

注：与蔗糖浓度30 g·L组比较，P<0.05

Note：compared with the sucrose 30 g·L-1 group，1)P<0.05

表2 不同氮源对西洋参细胞影响. n=3，±s

Tab.2 Effects of nitrogen sources on suspension cell of P.quinquefolium L. n=3，±s

NH4+/NO3- 0/60 7/53 12/48 20/40 30/30

注：与NH4/NO3为20/40组比较，P<0.05

Note：compared with the NH4+/NO3- is 20/40 group，1)P<0.05

Dry weight growth rate

2.70±0.011) 4.05±0.25 5.33±0.04 5.40±0.02 5.38±0.41

Ginsenoside Re/% 0.440±0.0671) 0.205±0.003 0.204±0.051 0.184±0.024 0.164±0.015

Ginsenoside Rb1/%

0.248±0.002 0.208±0.004 0.240±0.026 0.126±0.044 0.097±0.003

Polysaccharide/% 13.5±0.341) 5.78±0.51 5.52±0.08 3.06±0.09 3.00±0.14

表3 不同磷源对西洋参细胞影响. n=3，±s

Tab.3 Effects of phosphate sources on suspension cell of P.quinquefolium L. n=3，±s

KH2PO4 concentration/mmol·L-1

0.31 0.63 1.25 2.50 5.00

注：与KH2PO4 1.25 mmol·L组比较，P<0.05

Note：compared with the KH2PO4 1.25 mmol·L-1 group，1)P<0.05

Dry weight growth rate

3.32±0.33 5.41±0.02 5.40±0.98 5.40±0.03 7.83±0.141)

1)

Ginsenoside Re/% Ginsenoside Rb1/% Polysaccharide/%

0.050±0.003 0.401±0.0041) 0.276±0.031 0.287±0.025 0.125±0.011

0.008±0.022 0.330±0.0411) 0.139±0.052 0.135±0.033 0.129±0.001

2.05±0.441) 5.38±0.34 4.19±0.58 2.38±0.031) 2.51±0.041)

3 讨 论

3.1 碳源对西洋参细胞培养的影响

植物组织培养中被培养的外植体由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化 合物作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖最为常用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还有维持培养基一定渗透压的作用[5]。研究发现，添加蔗糖的西洋参细胞干重生长率、人参皂苷以及多糖的含量最高，尤其对多糖影响显著。在植物体内许多实验都证明，蔗糖是主要的运输形式。蔗糖在培养物细胞间可通过胞间连丝进行运输，蔗糖进入细胞后经水解形成葡萄糖并释放能量，葡萄糖再参与代谢，与核苷酸结合形成糖核苷酸，构成多糖合成的前体。 3.2 氮源对西洋参细胞培养的影响

不同氮源对植物器官生长和次生代谢的影响不同。在一个培养周期中植物器官先利用培养基中的铵基氮，然后在硝酸还原酶的作用下将硝态氮还原成铵

态氮再被利用。虽然外植体直接利用的是铵态氮，但当铵态氮超过一定量时对外植体有毒害作用，因此硝态氮更安全。一般来说，低比例NH4+/NO3-更适合组织或细胞生长。本实验结果表明，NH4+是细胞生长的重要因素，NO3-作为唯一氮源时皂苷、多糖含量最高，NH4+的加入抑制了皂苷和多糖的合成。NH4+抑制皂苷积累的影响机理较为复杂，包括转录、蛋白水虽然添加NH4+会抑平以及NH4+对NO3-的影响等[6]。

制皂苷和多糖的合成，但细胞对N的摄取率会高于单独使用NH4+或NO3-作为氮源[7]，因此在实验中通常采用具有一定比例的混合氮源。 3.3 磷源对西洋参细胞培养的影响

磷是组成核酸、磷脂、腺苷三磷酸以及许多辅酶的元素，参与许多物质的合成和植物的各种生理生化过程，是植物组织培养中重要的营养元素。通常情况下，植物组织培养基的磷源在培养早期就被组织或细胞吸收，吸收的磷源能够促进组织或细胞生长直到其被消耗完。

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磷源对于次生代谢物的生物合成也起非常重要的作用，不同植物的次生代谢合成所需磷酸盐浓度不同。Liu等[8]发现，人参细胞培养中最适于皂苷和多糖合成的磷酸盐浓度分别为1.04和0.42 Zhang等[9]报道，磷酸盐浓度为1.25?3.75 mmol·L-1；

mmol·L-1时促进三七细胞的生长和皂苷的合成。本实验表明，较低浓度的KH2PO4不利于细胞生长和有效成分的合成。培养物一旦接触到培养基，就会利用P合成ATP，ADP，进行能量代谢和物质合成。因此，减少KH2PO4的量，就会抑制细胞生长和有效成分合成。当培养基中KH2PO4浓度为0.63 mmol·L-1时，人参皂苷Re、Rb1和多糖的含量最高，因此，建议把MS培养基中KH2PO4浓度由1.25 mmol·L-1降低为0.63 mmol·L-1。

研究中发现，在合适的培养条件下，西洋参细胞培养物中多糖含量高于栽培西洋参（3.99%?4.58%），最多可以达到栽培西洋参的3倍，原因可能是培养基中丰富的碳源以及其他营养成分促进了初级代谢产物多糖的生物合成。这一结果为今后大规模培养西洋参细胞生产西洋参多糖，开发系列保健品和化妆品提供了理论依据。

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saponin and polysaccharide by cell suspension cultures of Panax ginseng and Panax quinquefolium L[J]. Process Biochem，1998，33(1)：69-74. [4] CHEN J H，XIE M Y，NIE S P，et al.Determination of

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adventitious roots (Ⅱ)Effects of carbon，nitrogen， and phosphate sources on culture of Salvia miltiorrhiza adventitious roots[J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2007，38(6)：907-911. [6] BLOOM A J，SUKRAPANNA S S，WARNER D L. Root respiration

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high-affinity nitrate transporter genes and high-affinity nitrate influx by nitrogen pools in roots of barley[J]. Plant Physiol（植物生理学通讯），2000，123，307-318. [8] LIU S，ZHONG J J. Phosphate effect on production of genseng

saponin and polysaccharide by cell suspension cultures of Panax genseng and Panax quinquefolium L[J]. Process Biochem，1998，33(1)：69-74. [9] ZHANG Y H，ZHONG J J. Hyperproduction of ginseng saponin and

polysaccharide by high density cultivation of Panax notoginseng[J]. Enzyme Microb Technol，1997，21：59-63.

（收稿日期：2008-07-15）

新医改与医院药学发展高级研讨会在长沙市召开

由中国药学会主办，湖南省药学会、《中国药学杂志》市场部承办、株洲千金药业股份有限公司协办的“新医改与医院药学发展高级研讨会”，于5月16日在长沙市召开，来自全国医院药学届的200余名代表，参与了此次盛会。会议邀请知名医院药学专家和医改专家到会解读新医改，共同探讨，分享研究成果，深入了解新医改精髓，及时把握未来发展方向。

湖南省经济委员会刘送保副主任、中国药学会副理事长李大魁教授、湖南省食品药品监督管理局饶健副局长、株洲千金药业股份有限公司朱飞锦董事长为会议作了开幕致辞。

会议有五位学者、专家进行了演讲，现场还就一些热点问题进行了专题讨论、互动问答。李大魁教授作了《基本药物制度与当前医院药学》专题讲座，介绍了新医改中的基本药物制度学习心得，从多层次、多方位理解了国家基本药物政策的必要性和紧迫性，也深刻指出在目前形势下，寻找有效路径落实国家的新医改方案是广大医院药学工作者应该做的事情，进一步阐述了医院药师的当前任务。

沈群红教授《新医改医药分开为医院药学工作带来的机遇与挑战》的报告，基于大量的调研数据，揭示了广大病人及医务工作者、药学工作者对医药服务的看法和需求；也让我们看到了国外同行的动态，政府及医院管理者的想法，对大家的启发非常大。

李焕德教授《中医药理论对现代药学研究的启示》的报告，也是基于大量的实例，揭示了中医药理论对现代药学研究的启示，有非常深远的意义。推动和发展祖国传统医药是我们每个人的责任，将中医药理论与现代药学研究有机结合，是发扬传统医药的具体体现。

来自中央音乐学院的赵世民老师主要阐述了艺术养生的主题，向大家展示了音乐艺术的魅力，他生动而有趣的讲座，给与会代表别开生面、耳目一新的视野开阔，给紧张的会议带来轻松和快乐。罗杰英教授就千金药业的两个新产品“千金椿乳凝胶”和“妇科断红饮胶囊”做了重点介绍。

此次会议给与会代表留下了深刻印象，除对会议内容安排本身有许多感触外，还对千金人的严谨态度和职业水准赞不绝口。

[本刊讯]

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