生防放线菌对西瓜根域微生态的调整效应

第36卷　第4期2008年4月西北农林科技大学学报(自然科学版)

JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat.Sci.Ed.)Vol.36No.4

April2008

生防放线菌对西瓜根域微生态的调整效应

周永强

a,b

＊

,薛泉宏,杨　斌

ba,b

,张晓鹿

a,b

,许英俊

a,b

,郭志英,林超峰

ba,b

(西北农林科技大学a生命科学学院,b资源环境学院,陕西杨凌712100)

[摘　要]　【目的】探讨接种生防放线菌对西瓜根域微生物区系的影响。【方法】采用营养钵育苗基质拌菌法接种,进行盆栽和小区种植,通过稀释平板涂抹法测定西瓜根区、根表土壤及根内的细菌、真菌和放线菌数量,并对优势细菌和真菌进行了初步鉴定。【结果】生防放线菌Act1接入西瓜育苗基质后,西瓜根域细菌数量较对照提高3.3%～1263.2%,其中西瓜根表土壤中芽孢杆菌数量较对照增加122.2%～867.7%;放线菌数量提高17.8%～478.4%;真菌数量减少29.2%～45.2%,其中接种5.0g/kg放线菌制剂处理西瓜根区和根表土壤中镰刀菌数量较对照分别降低55%和60%;细菌/放线菌较对照提高75.4%～369.5%。接种100d后,西瓜根域土壤中Act1活菌数量仍然高达106g-1以上。【结论】生防放线菌Act1具有较好的定殖稳定性,能够促使西瓜根域土壤由真菌型向细菌型转变,可在西瓜根域形成含有大量拮抗性放线菌、可抗御西瓜枯萎菌等土传病害致病菌的生物屏障。

[关键词]　生物防治;西瓜;连作障碍;土传病害;放线菌;微生物区系;微生态[中图分类号]　S154.36;S154.39

[文献标识码]　A

[文章编号]　1671-9387(2008)04-0143-08

Adjustedeffectofinoculatingwithbiocontrolactinomycesonmicrobialfloraofwatermelonrootingzone

ZHOUYong-qiang,XUEQuan-hong,YANGBin,ZHANGXiao-lu

a,bba,b

XUYing-jun,GUOZhi-ying,LINChao-feng

a,b

b

a,b

a,b

,

(a.CollegeofLifeSciences,b.CollegeofResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】Thestudywastodiscusstheeffectofinoculatingwithbio-controlactinomycesonmicrobialfloraofwatermelonrootingzone.【Method】Withpotexperimentandplotexperiment,inocu-latingwithbio-controlactinomycesinnurserybedsoil,thequantiesofbacteria,fungiandactinomycesweredeterminedviadilutionandplating.Somedominativebacteriaandfungiwereidentifiedpreliminarily.【Re-sult】InoculatingwithAct1innurserybedsoilhadraisedthenumberofbacteriaandactinomycesintherootingzonesoilofwatermelonandreducedfungithenumberof.Thequantityofbacteriaincreasedby3.3%-1263.2%,thequantityofgemmabacillusofwatermelonrootsurfacesoilincreasedby122.2%-867.7%,actinomycesincreasedby17.8%-478.4%,fungidecreasedby29.2%-45.2%,thereintothedestinyofFusariuminthewatermelonrhizospheresoilandrootsurfacesoilinoculatedby5.0g/kgprepa-retiondecreasedmarkedlyby55%and60%respectively.B/Fincreasedby75.4%-369.5%.100daysaf-6-1

terinoculation,thenumberofAct1wasmorethan10g.【Conclusion】Theseresultsdemonstrateanex-pectantcolonizationstabilityofAct1.AfterinoculationwithAct1,themicrobialfloraofwatermelonrootingzonesoilchangedmarkedly,fromfungitypetobacteriatype.Inwatermelonrootingzonesoil,abiologicalbarrierformedmostlybybio-controlactinomycesagainstsoilborneplantdiseasessuchaswatermelonFusariumwilt.

＊[

[[[

收稿日期]基金项目]作者简介]通讯作者]

　2007-05-10

　陕西省科技攻关项目(2004K02-G7);国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD05B07)　周永强(1982-),男,山东金乡人,在读硕士,主要从事微生物资源研究。E-mail:zhouyq2005@http://wendang.chazidian.com　薛泉宏(1957-),男,陕西白水人,教授,博士生导师,主要从事微生物资源研究。E-mail:xueqhong@http://wendang.chazidian.com

Keywords:biologicalcontrol;watermelon;continuouscroppingobstacle;soilborneplantdiseases;acti-nomyces;microbialflora;micro-ecosystem

　　根域包括根系、根表及根区土壤。根区土壤指

根系密集分布区、与根系紧密结合的根周围的土壤。根区土壤受根系生理活动和生化代谢影响强烈。根域微生物数量和组成与作物关系极为密切,对作物健康及生长影响很大。根腐类土传病的发生与根域内病原微生物数量大幅度增加、微生态失调有关。接入大剂量人工筛选的生防放线菌,有可能改变根域微生物生态系统的组成,增加有益菌数量,将根域微生态系统控制在有利于作物生长、抑制病原菌繁殖侵染的状态,以保证作物生产正常进行。

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fu-sariumoxysporumschlechlendahlf.sp.melonis(Leachatcurrence)snyderetHansen]引起的世界性土传病害,是西瓜的主要病害之一,其发生与连茬种植所致的根域病原菌数量上升及根域微生态系统质量下降有关。随着西瓜种植面积的不断扩大,轮作难度增加,枯萎病为害逐年加重,重茬地发病率达30%～80%,甚至绝收[1]。目前,西瓜枯萎病防治主要依赖化学农药,但化学农药防效差,且存在农药残留、易使病原菌产生抗药性等问题。因此,寻找新的防治途径已成为西瓜枯萎病控制的热点问题,其中生物防治已成为人们关注的新的研究方向[2-4]。研究表明,接种非致病镰刀菌、丛枝菌根菌、芽孢杆菌、荧光假单胞菌、绿色木霉、哈茨木霉以及绿色木霉和芽孢杆菌混合制剂对西瓜枯萎病均有一定防效

[1,5-13]

盆栽试验筛选得到,根据形态学和培养特征鉴定为

[14]

链霉菌属白孢类群(S.Albacores),该菌对西瓜枯萎菌有明显的拮抗作用[15-16]。

1.1.2　培养基　牛肉膏蛋白胨琼脂(BPA),马铃薯蔗糖琼脂(PDA),高氏1号(GA)。1.1.3　供试西瓜品种　“特大黑甜王”,购自陕西省杨凌杨星种苗开发有限公司。

1.1.4　基质土　取农田耕层土壤,去除石子和草根后过筛,向过筛细土中添加尿素和磷酸氢二钾作底肥(每kg土加入0.09gN,0.16gP2O5,0.11gK2O),充分拌匀1.2　方　法

[18]

[17]

。

1.2.1　育苗及盆栽试验　试验于2006-04-09在陕西杨凌柳林制药厂院内进行。设盆栽、小区两种种植方式。育苗土和盆栽土中放线菌制剂接种量均设0(CK),2.5,5.0g/kg(菌剂质量占土壤质量的比例)3个水平。按试验方案接种量向土壤中接入放线菌制剂,充分拌匀后装入营养钵和塑料盆中,装土量分别为150g/钵和1.3kg/盆。将催芽露白的西瓜种播入营养钵中,普通苗床保温培养。待营养钵内西瓜幼苗长出2片真叶时,将营养钵脱袋,将部分西瓜苗连同袋内土壤移植到塑料盆中,表面覆盖细沙,以减少水分蒸发;其余西瓜苗连同袋内土壤移栽至小区,常规管理。每处理重复20株。

1.2.2　样品采集　(1)盆栽试验。开花前每个处理选择有代表性的盆,取出植株及营养士,去除表土,用采样铲切取主根及其周围3cm区域内土壤装入自封袋,立即带回实验室分离。此外,采集未栽植西瓜盆土样,检查接入放线菌Act1的存活数量。(2)小区试验。西瓜收获完毕(播种后100d)采样,方法同1.2.2(1)。1.2.3　微生物区系测定　(1)样品的制备。根区土:将附着在西瓜根系上的土抖落,称取10g,置于装有少量石英砂和90mL无菌水的三角瓶中,在摇床上振荡30min后备用。

根表土:指根系上附着的大量土抖落后根表面仍粘附的少量土壤。将根剪下,称量(W1)后置于装有少量石英砂和90mL无菌水的三角瓶中,在摇床上振荡30min,取出根,用吸水纸将根表面水吸干后称量(W2),W1-W2为根表土质量。

根系:将洗去根表土的西瓜根在体积分数75%

,但

尚无利用放线菌活菌制剂防治西瓜枯萎病的研究报

道。此外,目前对接种生防细菌及真菌产生的根域微生态效应缺少研究,难以从机理上对生防菌的作用做出解释,限制了土传病害生防技术的深入研究。本研究探讨了接种生防放线菌对西瓜根域微生态系统的调整效应,其结果不仅有助于解释生防放线菌接种对西瓜枯萎病的防治机理,而且对揭示其他作物土传病害生物防治的微生态机制具有方法学上的意义。

1　材料与方法

1.1　材　料

1.1.1　放线菌制剂　由1号放线菌Act1经固体发酵制成,菌剂活菌数为5×1010g-1。该菌由西北农林科技大学微生物资源研究室,通过对分离自青藏高原的5000余株放线菌,进行皿内拮抗性筛选和

酒精中处理30s,再用1g/L的升汞处理2min,用无菌水冲洗5次后,将根放在无菌研钵中,加入10

mL无菌水和灭菌石英砂充分研磨,备用[19]。

(2)分离计数。对制备好的样品采用稀释平板涂抹法进行分离计数

[17]

Δ/%=[(接种处理-不接种对照CK)/不接种对照CK]×100%。

式中:接种处理、不接种对照分别指接种、不接种处理微生物数量。

。细菌用BPA培养基,培

养3d后计数、挑菌;真菌用PDA培养基(倒皿前加

灭菌乳酸使其终浓度为3mL/L),培养4d后计数、挑菌;放线菌用GA培养基(倒皿前加入灭菌K2Cr2O7使其终质量浓度为80μg/mL),培养7d后计数、挑菌。Act1的确认:通过与同步培养平板上1号放线菌的菌落形态比较鉴定后计数。培养温度均为28℃。

(3)优势菌鉴定。挑出菌株的鉴定参照文献[17,20-23]的方法。

1.2.4　数据处理　接种效应(Δ/%):表示生防菌接入引起的细菌、真菌、放线菌数量的增长率,计算公式如下:

2　结果与分析

2.1　生防放线菌对西瓜根域微生物数量的影响2.1.1　细　菌　由表1可以看出,接种放线菌制剂对西瓜根域细菌数量影响较大。在根区土壤中,放线菌制剂接种量为2.5,5.0g/kg时,盆栽西瓜根区细菌数量较对照分别提高48.7%,87.4%;小区西瓜根区细菌数量较对照分别提高165.3%,232.7%。根表土壤细菌也表现出相同的趋势:盆栽西瓜根表细菌数量较对照分别提高119.1%,75.8%,小区西瓜根表细菌数量较对照分别提高90.7%,204.0%。

表1　生防放线菌对西瓜根域微生物数量的影响

Table1　Effectofbiocontrolactinomycesonmicrobesquantityofwatermelonrootingzone

种类Kind

部位Location根区Rhizosphere

细菌Bacteria

根表Rootsurface根系Root根区Rhizosphere

真菌Fungi

根表Rootsurface根系Root

放线菌Actino-myces

根区Rhizosphere根表Rootsurface根系Root

测试项目Item

总数/(×107g-1)Totalnumber

Δ/%总数/(×108g-1)Totalnumber

Δ/%

总数/(×103g-1)Totalnumber

Δ/%

总数/(×104g-1)Totalnumber

Δ/%

总数/(×104g-1)Totalnumber

Δ/%总数Totalnumber总数/(×107

7

接种量/(g·kg-1)Inoculationamount

盆栽试验Potexperiment小区试验Plotexperiment0(CK)1.19-1.78-1.84-0.86-4.67-02.64-0.37-0

number

2.51.7748.73.90119.113.83651.61.2039.510.88133.0

03.8445.81.19221.6

5.02.2387.43.1375.81.903.30.927.03.92-16.1

03.1117.82.14

478.4

0(CK)0.98-1.50-9.72-0.65-7.04　　-01.07　-3.93

　-0

2.52.60165.32.8690.7132.51263.20.8632.33.86-45.2

01.9683.25.8749.40

5.03.26232.74.56204.036.72277.80.46-29.28.1315.504.73342.111.73

198.5

g-1)Total

Δ/%

总数/(×10g)Totalnumber

Δ/%

总数Totalnumber

-1

　　接种放线菌制剂对西瓜根系细菌数量也有明显

影响。在接种2.5,5.0g/kg放线菌制剂处理中,盆栽西瓜根系细菌数量较对照分别增加651.6%,3.3%,小区西瓜根系细菌数量较对照分别增加1263.2%,277.8%。

以上结果表明,外源接入特定放线菌制剂对西瓜根域细菌数量会产生强烈影响。细菌在微生物3大类群中数量最多、比例最大,决定着植物根域微生态环境的菌群平衡和物质能量的转化速度。因此,生防放线菌接入引起的细菌数量变化会改变西瓜根

域原有微生态系统的平衡,产生一系列复杂的未知效应。

2.1.2　真　菌　由表1可以看出,接种放线菌制剂对西瓜根域真菌数量也有一定影响。在根区土壤中,放线菌制剂接种量2.5g/kg处理,盆栽和小区西瓜根区土壤真菌数量较对照分别提高39.5%和32.3%;5.0g/kg处理小区西瓜根区土壤真菌数量较对照减少29.2%。在根表土壤中,放线菌制剂接种量2.5g/kg处理盆栽西瓜和5.0g/kg处理小区西瓜根表真菌数量分别较对照提高133.0%和

15.5%;5.0g/kg处理盆栽西瓜和2.5g/kg处理小区西瓜根表真菌数量分别较对照减少16.1%,

45.2%。在盆栽和小区试验中,西瓜根系内均未发现真菌。

2.1.3　放线菌　由表1可以看出,接种放线菌制剂对西瓜根域放线菌数量影响显著。盆栽与小区试验中,接种放线菌能明显增加西瓜根区和根表的放线菌数量。在根区土壤中,接种2.5,5.0g/kg放线菌制剂,盆栽与小区西瓜根区放线菌数量较对照分别增加45.8%,17.8%与83.2%,342.1%。在根表土壤中,接种2.5,5.0g/kg放线菌制剂,盆栽与小区西瓜根表放线菌数量较对照分别增加221.6%,

478.4%与49.4%,198.5%。在盆栽和小区试验中,均未发现西瓜根系存在放线菌。

从表1还可以看出,接种放线菌制剂后,西瓜开花期(盆栽)和收获后(小区)西瓜根区和根表土壤中仍然存在大量放线菌。表明接入的放线菌能在西瓜根区土壤和根表定殖,这种效应有利于抑制西瓜根区及根表土壤病原菌的大量繁殖和侵染根系。2.2　生防放线菌对西瓜根域微生物3大类群组成

比例的影响

从表2可以看出,接种供试生防放线菌对细菌(B)、真菌(F)和放线菌(A)3大类群组成比例的影响不同。

表2　生防放线菌对西瓜根域微生物3大类群组成比例的影响

Table2　Effectofbiocontrolactinomycesonratioofthethreemajorgroupsofwatermelonrootingzone

项目Item

细菌/放线菌B/A放线菌/真菌A/F细菌/真菌B/F

部位Location

根区Rhizosphere根表Rootsurface根区/(×103)Rhizosphere根表Rootsurface根区/(×10)Rhizosphere根表/(×103)Rootsurface

3

接种量/(g·kg-1)Inoculationamount

盆栽试验Potexperiment0(CK)0.4548.13.0779.21.38

3.81

2.50.4632.83.20109.41.48

3.58

5.00.7214.63.38545.92.42

7.98

小区试验Plotexperiment0(CK)0.923.81.65558.21.51

2.13

2.51.324.82.281520.73.02

7.41

5.00.693.910.281442.87.09

5.61

2.2.1　根区土壤　在盆栽试验中,接种放线菌制剂

对根区土壤B/A、A/F影响不大,但可提高根区土壤B/F。如0(对照),2.5及5.0g/kg放线菌制剂处理根区土壤,B/A分别为0.45,0.46及0.72,A/F分别为3.07,3.20及3.38,接种放线菌和对照无明显差异;0(CK),2.5及5.0g/kg放线菌制剂处理根区土壤,B/F分别为1.38,1.48及2.42,接种5.0g/kg放线菌制剂处理较对照提高75.4%。2.2.2　根表土壤　对根表土壤而言,接种放线菌制剂能显著增加根表土壤A/F和B/F,降低根表土壤B/A。盆栽试验中,接种2.5及5.0g/kg放线菌制剂的根表土壤,A/F分别较对照提高38.1%和589.3%,而B/A分别较对照降低32.2%和69.8%。

根表是病原菌通过侵染进入作物根系的门户。根表微生物组成变化对作物抗根腐类土传病害有重要影响。B/F增大即意味着F/B减小,反映出土壤由真菌型向细菌型转变[24]。有研究认为,真菌型土壤是地力衰竭的标志,细菌型土壤是土壤肥力提高的一个生物指标。因此,生防放线菌接入引起的土壤微生物组成比例改变,标志着根域微生态系统质量的提高。

小区试验中,接种放线菌后根区、根表土壤A/F、B/F明显增大,其中接种2.5,5.0g/kg放线

[25]

菌制剂处理的根区和根表土壤B/F较对照分别增

加100%,369.5%和247.9%,163.4%。

以上结果表明,接种生防放线菌后,西瓜根区和根表土壤微生物区系发生了变化,真菌比例降低。这种改变说明西瓜发生真菌性土传病害的风降降低。

2.3　生防放线菌对西瓜根域真菌种群组成的影响

由表3和表4可以看出,接种放线菌制剂对西瓜根区和根表土壤真菌种群组成有一定影响。2.3.1　对西瓜根区土壤真菌种群组成的影响　除细菌和放线菌外,土壤中真菌数量及其种群组成对作物生长和健康状况影响很大。有益真菌数量多,在真菌中占的比例大,作物不发病;相反,土传病害发生严重。镰刀菌中有许多致病菌,其数量和比例下降表明土壤微生态系统的抗病性提高

[7]

。

　　从表3可以看出,小区试验中接种2.5及5.0g/kg放线菌制剂处理,西瓜根区土壤镰刀菌数量较对照分别下降18.6%和55.1%,镰刀菌数量占真菌总数的比例分别下降38.5%和37.4%,表明接种生防放线菌降低了土传真菌病害发生的几率。在盆栽试验中,接种放线菌制剂对镰刀菌占真菌总数比例的降幅较小,接种2.5及5.0g/kg放线菌制剂处理分别较对照降低8.3%和18.4%。接种放线菌制剂

后,木霉、黑曲霉的数量及占真菌总数比例的变化趋势与镰刀菌基本相同。

表3　生防放线菌对西瓜根区土壤真菌种群组成的影响

Table3　Effectofbiocontrolactinomycesonfungipopulationcompositionofwatermelonrhizosphere

真菌种类

Fungivariety镰刀菌Fusarium木霉Trichodema黑曲霉

Aspergillusniger青霉Penicilliumsp待定属-1Genus-1待定属-2Genus-2

合计Total

测定项目

Item

数量/(×103g-1)Quantity占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×103g-1)Quantity占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×10g)Quantity占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×10g)Quantity

占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×10g)Quantity

占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×103

g

-1)Quantity3

-13

-13

-1

接种量/(g·kg-1)Inoculationamount

盆栽试验Potexperiment0(CK)2.3827.70.263.10.44.6

0.9310.82.1224.62.5129.28.60

number

2.53.0425.40.090.80.272.2

2.621.62.2418.73.7631.312.00

5.02.0822.60.171.90.262.8

3.1234.01.314.22.2624.59.20

小区试验Plotexperiment0(CK)2.7442.30.629.60.182.7

1.523.30.8913.70.538.26.48

2.52.2326.00.718.30.091.0

1.4316.74.0246.90.091.08.57

5.01.2326.50.357.600

1.5834.01.0522.60.449.44.65

占真菌总数的比例/%Proportion真菌总数/(×103

g

-1)Total

2.3.2　对小区试验中西瓜根表土壤真菌种群组成的影响　根表是西瓜根系与土壤直接接触并相互影响的区域。根表真菌种群的组成决定生防菌的抗病效果。从表4可以看出,当放线菌制剂接种量达5.0

g/kg时,小区试验西瓜根表土壤中镰刀菌数量及其占真菌总数的比例分别较对照降低60.2%和65.5%,在放线菌制剂接种量较低时(2.5g/kg),镰刀菌数量没有明显变化,但其占真菌总数的比例增加幅度较大。由此推知,只有当放线菌接种量达到较高水平时,才能使西瓜根系表面镰刀菌数量显著降低,而使根区土壤中镰刀菌数量降低仅需少量生

防放线菌。

从表4可知,在根表土壤中,接种放线菌制剂后小区试验中木霉数量及其占真菌总数的比例变化不大,青霉数量及其占真菌总数的比例有所下降,与根区土壤中的变化趋势相反(表3)。

西瓜土传连茬病害主要是由尖孢镰刀菌西瓜专化型引起的西瓜枯萎病。由以上结果可知,1号生防放线菌的接入可有效控制西瓜根区土壤中镰刀菌的密度,降低西瓜枯萎病发生的机率;从对镰刀菌的控制能力看,5.0g/kg放线菌接种量的效果优于2.5g/kg。

[10]

表4　生防放线菌对小区试验中西瓜根表土壤真菌种群组成的影响

Table4　Effectofbiocontrolactinomycesonfungipopulationcompositionofplotexperimentalwatermelonrootsurface

真菌种类

Fungivariety

4

测定项目Item

数量/(×10g)Quantity

占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×104g-1)Quantity

占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×103g-1)Quantity占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×103g-1)Quantity占真菌总数的比例/%Proportion数量/(×103g-1)Quantity占真菌总数的比例/%Proportion真菌总数/(×104g-1)Totalnumber

-1

接种量/(g·kg-1)Inoculationamount

0(CK)1.18

16.82.4735.10.911.32.6537.76.49.17.04

2.51.16

30.10.7419.21.12.71.6943.81.594.13.86

5.00.47

5.81.7421.41.161.45.1162.96.978.68.13

镰刀菌Fusarium青霉Penicilliumsp木霉Trichodema待定属-1Genus-1待定属-2Genus-2合计Total

2.4　生防放线菌对西瓜根域芽孢杆菌数量的影响

芽孢杆菌(Bacilliusspp.)在自然界分布非常广泛,生理特性多样,可以产生防治植物病害的抗菌

物质,是土壤和植物微生态系统的优势种群之一,是重要的植物病害生防微生物。芽孢杆菌数量增加对

提高西瓜根域微生态系统的抗病性有益。

由表5可以看出,盆栽和小区试验中,接种2.5,5.0g/kg放线菌制剂处理西瓜根区土壤芽孢杆菌数量分别较对照增加89.6%,193.0%和235.2%,414.1%,根表土壤分别较对照增加277.2%,