酪氨酸酶

酪氨酸酶

概念：酪氨酸酶(EC 1．14．18．1)是一种含铜的氧化还原酶，它与生物体合成色素直接相关．（长的黑有很大的一部分原因在自己）在人体中，它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关

（酪氨酸酶的分布与动物的生理功能息息相关，不同动物的酪氨酸酶在体内分布的部位不同．多数昆虫在正常生理状态下，酪氨酸酶以酶原的形式存在，不同类型的酪氨酸酶存在于昆虫的特定部位，以完成特定的生理功能．美洲蜚蠊存在于血红细胞内，而麻蝇则仅存在于血浆中，并且在表皮中主要以活化形式的酪氨酸酶存在．昆虫酪氨酸酶除参与黑色素的形成外还是唯一参与角质硬化的酶．昆虫高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵，并为柔软的元脊椎动物身体提供了保护．在节肢动物中，酪氨酸酶还参与其他两种重要的生理过程—— 防御反应和伤口愈合．

哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中，使体表着色，从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用．哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中，黑素细胞是存在于皮肤，发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞[1“]．酪氨酸酶功能减退或缺失时，即会影响黑色素代谢，从而发生疾病如白癫疯和白化病．动物与人的常染色体隐性疾病也与酪氨酸酶的缺失或活性下降有关．）

作用机制：酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L．酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后，形成黑色素，与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关，并与昆虫的蜕皮（蝉蜕可以入药）和（苹果）果蔬的褐化有很大关系

（黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段，第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L_3，4一二羟基丙氨酸(L_多巴)(单酚酶活性)，并进步将L_多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性)。这两步反应都是由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能．第二阶段从多巴醌(DOPAqui—non)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程．真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素，极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素经异构、脱羧生成5，6一二羟基吲哚(DHI)，5，6一二羟基吲哚(DHI)由酪氨酸酶催化氧化为真黑色素的前体吲哚一5，6一醌(IndQu)；褪黑素生成，多巴醌(DOPAquinon)与半胱氨酸(Cys)反应生成产生5-Cys一多巴及5-Cys一多巴醌，然后成环、脱羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成褪黑素．在第二阶段，只有少数几步反应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化，大部分反应都是自发的，因此酪氨酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶，第一阶段的两步反应是限速步骤．）

活性中心：酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成．在催化过程中，双核铜离子位点以3种形态存在，分别是氧化态、还原态和脱氧态．研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似、

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白化病概念：白化病是由黑色素合成相关基因突变导致黑色素沉着减少或缺失引起的一类遗传性疾病的总称。

白化病发病机理：TYR基因与OCA1 眼皮肤白化病I型 ，由酪氨酸酶基因异常引起，该 基因定位于1lql1—21，长度超过65 kb，包含5个外显子和4个内含子 ，编码由529个氨基酸残基

酪氨酸酶的抑制及激活：

羟基苯甲酸和羟基苯甲醛对酪氨酸酶均有明显得抑制作用，表l列出我们研究的几种该类物质的作用．（在这里大家可以看到最后一个不是羟基苯甲酸）熊果甙也是一种含酚基的化合物，对酪氨酸酶也有抑制作用，虽然其抑制效应明显比羟基苯甲醛和羟基苯甲酸差，但由于其副作用较小，已作为增白剂添加入美白化妆品中。

含间苯二酚结构的化合物大多是酪氨酸酶的抑制剂，它们可以与酪氨酸酶的双铜离子活性中心结合，大多数是酪氨酸酶的竞争性抑制剂．目前，4-己基间苯二酚已作为商品用于虾的保鲜

黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制作用（螯合作用）．桑色素(e)的3-和2‘ -羟基之间形成分子内氢键干扰了3-氢键和4-羰基与酶活性中心的铜形成螯合构

象。

从黑白块菌中提取出两种含硫的香味化合物 ，它们与酪氨酸酶的结合是属于缓慢结合型（如图4）．苯基硫脲、二硫苏糖醇和巯基乙醇，也是含硫化合物，它们均是酪氨酸酶的抑制剂，所不同的是这些化合物对酪氨酸酶的抑制作用是不可逆的．硫脲与酪氨酸酶还原态形式的酶结合(图5)，将导致永久性失活，其抑制作用主要是通过硫脲上的硫取代E 。 活性中心两个铜离子之间的氢氧化物桥联配体，从而与酶活性中心形成很牢固的结合，使化合物具有不可逆抑制酪氨酸酶的活性．含硫化合物中，亚硫酸盐及二氧化硫也均是酪氨酸酶的强效抑制剂，曾经作为果蔬的常用保鲜剂，由于安全性问题已被禁用． 固定化酶与溶液酶相比，具有以下一此优点：

(1) 固定化酶可重复使用，酶的使用效率得到提高，使用成本降低．尤其适合使用贵重酶的情况。

(2)固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染的、纯度较高的生成物，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

(3) 在多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可较长时间地使用储藏。

(4) 固定化酶具有一定的机械强度．可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，使反应过程能够管道化、连续化和自动化。

(5) 酶的催化反应过程更易控制。例如，当使用填充式反应器时，底物不与酶接触，即可使酶反应中止。

(6) 比溶液酶更适合于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协调效应使酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行。

(7) 辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体系合并使用，从而扩大其应用范围。 酶固定化采用的载体大致可分为以下四种：

(1)无机载体，常用的如活性炭、多孔玻璃、氧化物等。无机载体具有较高的机械强度和较好的化学稳定性，个易发生变形，可成功用于活塞式反应器 而不发生大的压力降。

(2)有机载体，如一些天然的高分子载体和合成的高分子载体。有机载体易发生形变，具有弹性，易加工成各种形态(如膜等)。固定酶的能力较强，可成功用于连续搅拌式反应器而小被磨损。近年来，‘人们还研究出了溶解性可调节的载体材料，可对环境条件(如pH、温度等)的变化作出应答而发生相变或溶胀一收缩变化．用其制备的固定化酶具有“均相反应，异相分离”的优点。另外，还将脂质体作为载体进行酶的固定化。

(3)复合载体，这类载体结合了无机载体和有机载体的优点。一般以无机载体为“核”包埋在高分f凝胶中，进行酶的固定化。

(4)生物大分子载体，如用单克隆抗体材料进行酶的固定具有较好的效果。 酶固定化后性质的变化

(1)酶活力降低。酶经固定化后，一般而言，其活力都会有所下降。

(2)酶的最适pH变化。酶的催化活性受pH值影响较大，在大多数情况下，酶催化反应在一定pH值条件下具有最大的反应速度，高于或低于此pH值，反应速度都会下降，通常称此pH为酶的最佳反应pH值

（3）酶经固定化后，大多数情况下其最佳反应温度会提高。这是因为酶分子被固定

化后，其热稳定性增强。随着温度的升高，酶的活力较溶液酶的活力降低的缓慢，因而可在较高的温度下获得最快的反应速度。酶的最佳反应温度对实际应用具有重要的意义。

(4)酶的稳定性增强。固定化酶的稳定性：酶的稳定性包括酶对各种试剂的稳定性(包括蛋白质变性剂、抑制剂等)、对蛋白分解酶的稳定性、对热的稳定性、储存的稳定性、重复使用稳定性等

酪氨酸酶的固定化：

采用壳聚糖(脱乙酰度为85％)作为载体，利用戊二醛载体交联法制备固定化酪氨酸酶。分两套工艺进行固定化。第一套工艺分两步：载体先经戊二醛处理，然后进行酶的固定化。第二套工艺分三步：首先进行戊二醛的处理，接着进行甲醛处理，最后进行酶的固定化。

制作工艺：选用泰和乌骨鸡，通过RT-PCR方法，使用宝生物工程（大连）有限公司和天根生化科技（北京）有限公司生产的PCR试剂盒，上海生物工程公司生产的Trizol，对酪氨酸酶进行体外扩增，找到RT-PCR方法的最佳反应条件。结果表明，通过RT-PCR方法能成功扩增出酪氨酸酶基因，并且用宝生物工程（大连）有限公司生产的试剂盒和上海生物工程公司生产的Trizol所得出的试验结果最佳，既无杂带也无引物二聚体，是一种理想的RT-PCR反应体系。