全血血栓与白色血栓诱导的肺栓塞小鼠模型的比较研究

208　 ????军????杂????2012年3月1日　第37卷　第3期

全血血栓与白色血栓诱导的肺栓塞小鼠模型的比较研究郑睿，万钧，姚建民

[摘要]　目的　对采用全血血栓及白色血栓诱导的肺栓塞小鼠模型进行评估，为选择简便、经济、成功率高、接近真实病理状态的小鼠急性肺栓塞模型提供依据。方法　健康雄性清洁级C57BL/6J小鼠122只，随机分为正常对照组(n=6)、假手术组(n=12)、全血血栓栓塞组(H组，n=30)及白色血栓栓塞组(W组，n=30)。小鼠麻醉后，分离暴露右侧颈静脉，栓塞组穿刺并注入自体全血血栓或白色血栓(每只动物40个栓子，每个栓子长1mm，直径1.05mm)，造成急性血栓性肺栓塞；假手术组注入等体积生理盐水。测定各组体循环血压、心率、右心室收缩压(RVSP)、外周血TNF-α水平，并行病理组织学观察了解栓塞效果。结果　小鼠肺栓塞建模成功率为100%。注栓后W组、H组及假手术组血压分别为55.5±4.8、58.2±4.2、67.2±2.6mmHg，与正常对照组(71.3±3.0mmHg)比较均明显降低(P<0.01)，且W、H组明显低于假手术组(P<0.01)，W组与H组比较未见明显差异(P>0.05)；注栓后W组、H组及假手术组心率分别为372±38、360±39、370±38次/min，与正常对照组(440±25次/min)比较均明显降低(P<0.01)，而前3组间比较差异无统计学意义。栓塞后12h W组、H组RVSP分别为29.6±1.7、30.9±1.9mmHg，显著高于假手术组及正常对照组(分别为19.3±1.9、19.6±1.6mmHg，P<0.01)；至栓塞后48h W组RVSP(28.5±3.1mmHg)与栓塞后12h比较无统计学差异(P>0.05)，与假手术组(21.1±1.2mmHg)及正常对照组(19.6±1.6mmHg)比较明显升高(P<0.01)，H组RVSP(21.0±1.5mmHg)与栓塞后12h比较明显降低(P<0.01)，与假手术组及正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)。注栓后1、6、12、24h，假手术组、W组、H组外周血TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)。Mallory磷钨酸苏木精(PTAH)及HE染色显示，栓子大多处于肺动脉段及亚段水平，栓塞切实可靠，且W组栓子48h自溶率(30%)明显低于H组(100%)。结论　白色血栓诱导的小鼠急性肺栓塞模型病理状态稳定，优于全血血栓诱导的肺栓塞模型。

[关键词]　肺栓塞；血栓形成；模型，动物

[中图分类号]　R563.5

[文献标志码]　A

[文章编号]　0577-7402(2012)03-0208-05

Comparative study on pulmonary embolism in mice induced by whole blood thrombus or white thrombus

ZHENG Rui1, WAN Jun2, YAO Jian-min1*

1

2

*Department of Cardiovascular Surgery, General Hospital of Beijing Command, Beijing 100700, ChinaDepartment of Physiology, Capital Medical University, Beijing 100069, ChinaCorresponding author, E-mail: jimyao@http://wendang.chazidian.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30770940) and Capital Medical Science Development Foundation (2009-2049)

[Abstract]　Objective　To evaluate pulmonary embolism in mice induced by whole blood thrombus or white thrombus, in order to provide a basis for choosing murine model of acute pulmonary embolism, which is easy to reproduce, less expensive, closer to the real pathological state, and with a high success rate. Methods　A total of 122 healthy and clean male C57BL/6J mice were divided randomly into normal control group (n=6), sham-operation group (n=12), whole blood thrombus group (H group, n=30), and white thrombus group (W group, n=30). After the mice were anesthetized, the right jugular vein was isolated and exposed. The prepared white or whole blood autologous thrombi were introduced into the jugular vain (40 thrombi for each animal; each 1mm in length, 1.05mm in diameter) to reproduce acute pulmonary thromboembolism. For the sham-operation group physiological saline of the same volume was infused. The systemic blood pressure, heart rate, right ventricular systolic pressure (RVSP), and TNF-α of the peripheral blood of each animal were then determined, and pathological examination was performed to check the effects of the embolism. Results　The success ratio of the reproduction of the murine model of pulmonary embolism is 100%. After the introduction of the embolus, the blood pressure (BP) of W group, H group and sham-operation group was 55.5±4.8, 58.2±4.2 and 67.2±2.6mmHg, respectively, which was significantly lower compared with that of the normal control group (71.3±3.0mmHg,

[基金项目]　国家自然科学基金(30770940)，首都医学科学发展基金(2009-2049)

[作者简介]　郑睿，主治医师，第三军医大学硕士研究生。主要从事心胸外科的基础与临床研究

[作者单位]　100700　北京　北京军区总医院心肺中心一区(郑睿、姚建民)；100069　北京　首都医科大学生理学系(万钧)[通讯作者]　姚建民，E-mail：jimyao@http://wendang.chazidian.com

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P<0.01). There was no difference in BP between the W and H group (P>0.05). After injecting the emboli, the heart rate of the W, H, and sham-operation group was 372±38, 360±39 and 370±38b/min, respectively, and they were significantly lower compared with the normal control group (440±25b/min, P<0.01); there was no difference between the first 3 groups. After 12h of embolization, the RVSP of W and H groups (29.6±1.7 and 30.9±1.9mmHg, respectively) was significantly higher than that of the sham-operation group and normal control group (19.3±1.9 and 19.6±1.6mmHg, respectively, P<0.01). After 48h of embolization, there was no difference in the RVSP (28.5±3.1mmHg) compared with that of 12h after embolization in the W group (P>0.05), However, there was a significant increase compared with the sham-operation group (21.1±1.2mmHg, P<0.01) and normal control group (19.6±1.6mmHg, P<0.01). In H group, RVSP 48h after embolization (21.0±1.5mmHg) showed a significant lowering compared with that of 12h after embolization, but there was no difference (P>0.05) compared with that of the sham-operation group and normal control group. The TNF-α content in peripheral blood showed no difference among the sham-operation group, W group, and H group at 1, 6, 12, and 24h after embolization (P>0.05). Mallory phosphotungstic acid haematoxylin and HE staining showed that most emboli were localized in the branches or sub-branches of pulmonary arteries, and embolization was authentic. Further, the autolysis rate of the emboli in W group (30%) was obviously lower than that in the H group (100%) after 48h. Conclusions　The murine model of acute pulmonary embolism reproduced with white thrombus exhibits a more steady pathological state, and is better than that induced by whole blood thrombus.

[Key words]　pulmonary embolism; thrombosis; models, animal

肺栓塞(pulmonary embolism, PE)为血栓性和(或)非血栓性栓子脱落堵塞肺动脉或分支引起的呼吸循环功能障碍综合征，是一种相对常见的心血管急重症，可因栓子堵塞肺动脉血管床而引起危及生命的右心衰竭，但通过及时、恰当的治疗，其右心功能衰竭在本质上是可逆的[1]。PE具有发病急、病情重且多变的特点，病死率高达7%～11%[2]，因此建立一种栓塞范围及严重程度可控的动物模型用于实验研究十分重要。目前制作肺栓塞动物模型的方法包括聚苯乙烯、玻璃等微球成分栓塞，注射各种促凝物质及全血制取血栓进行栓塞等，但均存在体内异物、栓塞范围无法控制、栓子不稳定等缺陷[3-4]。为解决上述不足，本研究采用全血血栓及白色血栓诱导的方法建立急性肺血栓栓塞(acute pulmonary thromboembolism，APTE)小鼠模型，并对两种诱导方式下肺栓塞的稳定性进行比较，为选择简便、经济、成功率高、接近真实病理状态的小鼠急性肺栓塞模型提供依据。1　材料与方法

1.1　实验动物及分组　健康雄性清洁级C57BL/6J小鼠122只，8～9周龄，体重22.0～25.5g，购自北京市维通利华公司，随机分为正常对照组(n=6)、假手术组(n=12)、全血血栓栓塞组(H组，n=30)及白色血栓栓塞组(W组，n=30)。1.2　栓子制作

1.2.1　白色血栓　取1ml注射器预充3.8%柠檬酸钠抗凝剂40μl，预注栓小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，尾静脉取血400μl(注意及时混匀)，置于离心管中550×g离心5min，将上层血浆(200μl)取出置于另一离心管中备用，吸取血浆

时尽量贴近分界面轻轻吸取，但勿吸起红细胞成分。预混凝血酶与CaCl2溶液，使其终浓度分别为10U/ml、0.5mmol/ml，取上述混合液50μl注入装有血浆的离心管中，混匀后用1ml注射器迅速吸出，注入毛细玻璃管(内径1.05mm，外径1.5mm)中，室温静置5min，将毛细玻璃管放入15ml离心管中，37.8℃水浴30min，然后将毛细玻璃管取出，对应相应小鼠编号，放入4～8℃冰箱备用。使用前30min取出，用生理盐水冲出毛细玻璃管中的栓子，剪成1mm长，共40个，经22G静脉输液针头伴随0.4ml生理盐水吸入注射器。

1.2.2　全血血栓　参照上述1.2.1方法尾静脉取血200μl后，迅速注入毛细玻璃管中，室温静置30min后，对应相应小鼠编号，放入4～8℃冰箱备用。使用前30min取出，用生理盐水冲出毛细玻璃管中的栓子，剪成1mm长，共40个，经22G静脉输液针头伴随0.4ml生理盐水吸入注射器。

1.3　急性肺栓塞模型制作　小鼠于取血制栓3d后，麻醉、固定、右侧颈部剪毛，碘酒、酒精消毒后沿颈静脉走行剪开颈部皮肤(<1cm)，显微镜下分离颈静脉至远心端及远心端分支处，于远心端套线(4-0)牵拉颈静脉，用静脉输液针缓慢注入(时间约15s)上述准备好的栓子，假手术组注入生理盐水0.4ml，去针后无菌棉球按压止血，观察无渗血后4-0可吸收线缝合切口。全部操作均在无菌条件下进行，30min内完成。

1.4　血压测量　采用Softron BP-98A血压仪经尾部测量小鼠体循环压。分别于取血制栓前、栓塞前、栓塞后15min内进行测量，测量时用Softron TMC-203保温仪维持被测小鼠周围温度为38.0℃。

1.5　右心室收缩压(RVSP)及右心指数测量　分别

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于栓塞前及栓塞后12、48h采用文献[5]的方法测定RVSP，单次测压后处死并留取标本。其中每组随机选择6只小鼠于48h穿刺测压后迅速取出心脏测量右心指数，并留取标本行病理切片染色。

1.6　病理组织学观察　W、H组于栓塞后1、24、48h随机选取6只小鼠，麻醉固定后，迅速取出心脏、肺脏等器官，灌注冲洗后中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色(主要用于观察炎症细胞浸润及全血血栓情况)及Mallory磷钨酸苏木精(PTAH)染色(主要用于观察白色血栓情况)，光镜下观察。

1.7　血浆肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平测定　分别于栓塞后1、6、12、24h断尾取血200μl，4℃下1000×g离心10min获取血浆，采用双抗体夹心法测定TNF-α浓度，所用试剂盒为ExCell公司产品。1.8　统计学处理　采用SPSS 18.0软件进行统计分析，数据结果以表示，多组间比较采用双因素方差分析，经验证方差均为齐性，组间两两比较采用Tukey或Scheffe检验，P<0.05为差异有统计学意义。2　结　　果

2.1　体循环压及心率变化　栓塞组小鼠抽血制栓后15min内的血压(59.5±3.6mmHg)明显低于抽血制栓前(71.4±3.3mmHg)及注栓前(抽血制栓后3d，71.3±1.3mmHg)，差异有统计学意义(P<0.01)，而注栓前与抽血前血压无明显差异(P>0.05)。注栓后W组、H组及假手术组血压分别为55.5±4.8、58.2±4.2、67.2±2.6mmHg，与正常对照组(71.3±3.0mmHg)比较明显降低(P<0.01)，且W组、H组血压明显低于假手术组(P<0.01)，W组与H组比较未见明显差异(P>0.05)；注栓后W组、H组及假手术组心率分别为372±38、360±39、370±38次/min，与正常对照组(440±25次/min)比较明显降低(P<0.01)，而前3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2　RVSP及右心指数变化　急性肺栓塞后12h，W组小鼠RVSP明显高于假手术组及正常对照组(P<0.01)，栓塞后48h仍高于假手术组及正常对照组(P<0.01)，与栓塞后12h比较无统计学差异(P>0.05)。急性肺栓塞后12h，H组小鼠RVSP明显高于假手术组及正常对照组(P<0.01)，但栓塞后48h即明显下降(P<0.01)，与假手术组及正常对照组比较已无统计学差异(P>0.05，表1)。栓塞后48h，W组及H组右心指数(分别为0.200±0.029、0.200±0.014)与正常对照组(0.211±0.032)比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3　血浆TNF-α浓度变化　栓塞后1、6、12、

24h假手术组、W组、H组血浆TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)，但6h、12h时间点3组血浆TNF-α水平与1h、24h比较均明显升高(P<0.01)，而1h与24h比较、6h与12h比较差异均无统计学意义(P>0.05，图1)。

表1　急性肺栓塞后小鼠右心室收缩压变化()Tab. 1　Right ventricular systolic pressure (RVSP) after acute pulmonary thromboembolism in mice (

)

Normal control group (n=6)

19.6±1.6

21.1±1.2　28.5±3.1(1)21.0±1.5(2)

(1)

Sham-operation group (n=12)19.3±1.9　White thrombus group (n=6)

29.6±1.7

Whole blood thrombus group (n=6)30.9±1.9(1)

　　(1)P<0.01 compared with normal control and sham-operation group; (2)P<0.01 compared with 12h after infusion

White thrombus group

Concentration of TNF-α (pg/ml)80

Whole blood thrombus groupSham-operated group

60

(1)

(1)

(1)

40

(1)(1)

(1)

20

1 6 12 24

时间(h)

图1　栓塞后小鼠血浆TNF-α水平变化

Fig. 1　Changes of plasma TNF-α level after acute pulmonary thromboembolism

(1)P<0.01 compared with 1h and 24h

2.4　病理组织学观察结果　小鼠肺组织切片HE染色于12、24h时间点在W组及H组均未见明显炎症细胞浸润。PTAH染色显示W组小鼠注栓后1h肺动脉段/亚段水平可见大量栓子存在(图2A)，24h后95%小鼠仍可见急性肺栓塞改变(图2B)，48h后约有30%小鼠肺血管中栓子大量减少(占1/6，图2C)或消失(占1/6)。HE染色显示H组小鼠注栓后1h栓子数量及分布与W组无明显区别(图2D)，24h后可见栓子大量破裂溶解(占1/6，图2E箭头所示)或消失(占5/6)，48h后未见任何栓子存在(图2F)。3　讨　　论

PE根据栓子类别可分为肺血栓栓塞、脂肪栓塞、羊水栓塞、空气栓塞、感染性栓子栓塞、瘤栓及其他物质栓塞等，其中肺动脉血栓栓塞约占PE的90%，其血栓主要来源于下肢近端深静脉血栓形成

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1h 24h 48h

White thrombus group

(PTAH)

Whole blood thrombusgroup (PTAH)

图2　注栓后两组肺组织病理组织学观察(×20)

Fig. 2　Histopathological observation of white thrombus group and whole blood thrombus group after thrombus-induced pulmonary embolism (×20)

Arrow in E indicates large number of ruptures and dissolution of embolism

(deep vein thrombosis, DVT)。本研究采用自体血栓注射模拟急性肺栓塞过程具有较强的代表性。血栓按其构成可分为白色血栓、红色血栓(全血血栓)、混合型血栓、纤维素性血栓，目前血栓制备多采用全血室温静置或与凝血酶混合的方法，主要用于模拟全血血栓栓塞。但有研究表明，全血血栓注入SD大鼠体内24h后其自溶率高达95%[6]，这与本研究中H组的结果较为一致。Kirchhof等[7]报道，白色血栓在栓塞模型兔体内14h后仍未见明显自溶，而对照的红色血栓自溶率高达37.5%(3/8)。因此，本研究采用纤维素含量相对丰富的白色血栓，同时参考其他学者的方法加以改良，使模型的质量及稳定性得到明显提高，栓子外观直视下呈乳白色，PTAH染色后可见栓塞后24h基本未见明显栓子自溶，48h后自溶比例(30%)较文献报道[6]亦明显降低，这对于自体纤溶作用明显的小鼠PE模型的稳定性是一个质的改善。

本研究发现，由于白色血栓取血量较大，在取血制栓后，小鼠血压降低较明显，为减少取血对实验的干扰，选择了在3d后进行注栓，此时小鼠血压与取血前比较未见明显差异。而全血血栓小鼠取血量较少，取血后即刻测量血压未见明显降低，3d后与取血前也没有明显差异。

APTE对机体的一个重要影响是血流动力学方面的改变[8]。本研究中，W组小鼠死亡1只(死亡率<10%)，死因为心跳骤停，可能与栓子堵塞主肺动脉导致右心室负荷过重及电机械分离有关。其余小鼠注栓后即刻均可见明显呼吸急促、幅度增大表现，且血压较对照组明显降低，心率虽有变化，但与假手术组比较无明显区别，可能其变化主要与手术操作有关，也有可能是肺栓塞后交感兴奋性增加而使心率升高，但被右心负荷加重所带来的影响所抵消。

本研究中未直接测量肺动脉压力，而是以右室压力间接反映肺动脉压的变化[5]。H组小鼠注入全血血栓后12h RVSP明显升高，但48h后已降至正常对照组及假手术组水平，且光镜观察显示肺栓塞栓子基本消失，提示在注栓后12～48h栓子及肺动脉压力改变明显，会给模型的稳定性造成显著影响。结合病理标本所见(24h时间点栓子大量溶解及破裂)，H组模型的病理状态在12～48h变化剧烈。因此，我们认为全血血栓栓塞模型用于研究超过12h的小鼠急性肺栓塞病理生理改变是不恰当的。W组注入白色血栓后12h所有小鼠RVSP均明显升高，48h时虽然RVSP总体水平仍高于正常对照，但仅有55%的小鼠RVSP与12h时间点相比无明显降低，说明此模型虽经改进，但用于慢性肺栓塞仍存在不足。但从该结果可以看出，此模型用于急性肺栓塞研究稳定性好，切实可行，且较颈静脉注射胶原、凝血酶或其激活剂等方法的死亡率明显降低[9-10]。此外，右心室盲穿虽有一定偏差，但由于右心导管具有迅速、简便、经济等优点，经过练习完全可以避免其不确定性。本实验中小鼠右心指数至48h未见明显改变，亦符合急性肺栓塞的病理生理特点。

炎症在静脉血栓栓塞的发生过程中具有重要作用，但是对于肺栓塞本身是否可引发炎症及其

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机制目前仍存在争议。本研究对造模后1、6、12、24h血浆中炎症标志物之一的TNF-α水平进行了测定，结果显示W组及H组与假手术组比较均无明显差异，与文献报道一致[11-12]，表明仅手术操作而非肺栓塞对小鼠造成了炎症刺激。我们认为临床上肺栓塞患者的炎症反应可能与栓塞前的基础病变有关，而动物模型中的炎症反应可能与栓子的异源性或注射的凝血酶等对栓子的影响有关。

另外，由于目前仍然缺乏分离富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)的统一标准，且小鼠自体血液可取量少，故本研究在血栓制备过程中采用较低转速、较短时间离心及抽取血浆时靠近分界面吸取等方法增加血浆中的血小板含量，但这也使得本法略显不足。血小板对栓子的抗纤溶作用较为重要[13]，因此本模型仍有改进的空间，可通过富集血小板等方式增加栓子的稳定性，从而将其应用范围扩展至慢性肺栓塞的研究。

综上所述，本研究观察并比较了全血血栓及白色血栓诱导小鼠肺栓塞的可行性及稳定性，结果显示，用白色血栓建立急性血栓性肺栓塞动物模型较全血血栓有着诸多优点，为今后进一步研究肺血栓栓塞症的病理机制及药物筛选奠定了基础。

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(收稿日期：2011-11-25；修回日期：2010-01-12)

(责任编辑：胡全兵)