基因工程实验讲义

上传者：姜胜林
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上传时间：2015-05-09
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基因工程实验讲义

动物DNA制备

一、实验目的

了解动物基因组DNA的提取原理和基本操作步骤，掌握从动物组织样品中制备高质量基因组DNA的方法。

二、实验原理

在EDTA和SDS等去污剂存在的条件下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，无水乙醇沉淀，可以得到动物基因组DNA。用此方法得到的DNA长度大约在100-200 kb之间，适用于PCR扩增、基因组文库构建和Southern杂交等实验分析。

三、实验材料

新鲜的动物组织。

四、实验仪器

高压灭菌锅，玻璃匀浆器，恒温水浴锅，台式高速冷冻离心机

五、试剂配制

1、组织匀浆液

100 mmol／L NaCI，10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），25 mmol／L EDTA（pH8.0）

2、蛋白酶K溶液

按10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 ℃保存。

3、裂解缓冲液

200 mmol／L NaCI，20 mmol／L Tris·HCI（pH 8.0），50 mmol／LEDTA（pH 8.0），1%SDS。

4、不含DNA酶的RNA酶溶液

将胰RNA酶溶解于10 mmol／L Tris·HCl（pH7.5）、15 mmol／L NaCl溶液中，RNA酶溶液的终浓度为l0 mg／mL。将酶液置于100 ℃水浴处理15 min，使DNA酶失活，缓慢冷却到室温，-20 ℃保存。

5、Tris饱和酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇混合液

酚：氯仿：异戊醇按体积比25：24：1配制，现配现用。

6、TE缓冲液

10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。

六、实验步骤

（一）DNA的提取

1、组织样品的处理

切取新鲜的（或冷冻的）动物组织1 g，除去结缔组织，用预冷至4 ℃的生理盐水清洗3次；在冰浴中剪碎后，置于玻璃匀浆器，加入约2.0 mL组织匀浆液匀浆至无明显组织块存在。

2、细胞裂解

将组织细胞移至2.5 ml离心管中，设定在4 ℃条件下5000 r/min离心30-60 s，弃上清液；向沉淀细胞中加入等体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K溶液至终浓度200 µg／mL，翻转混匀

（动作一定要轻柔）后于55 ℃水浴中缓慢振荡处理12-18 h。

在混合物中加RNA酶溶液至终浓度200 µg／mL，37 ℃水浴1 h。

3、酚／氯仿法抽提

裂解处理后的混合物中加入等体积的酚／氯仿／异戊醇（25：24：1）混合液，缓慢旋转摇匀5 min后4 ℃ 10000 r/min离心10 min；用宽口径吸管谨慎地吸取上层水相，转移至另一离心管中（注意勿吸出界面中蛋白沉淀），加等体积氧仿／异戊醇（24：1），4 ℃ 10000 r/min离心10 min 。如果界面或水相中蛋白含量较多，可重复操作2-3次。

4、乙醇沉淀

用宽口径吸管小心吸出上层含DNA的水相，转移至离心管中加1／10体积的3 mol／L醋酸钠溶液使终浓度达到0.3 mol／L，再向每管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，-20 ℃过夜。

12000 r/min离心10 min，弃上清液；75%的预冷乙醇洗涤一次，12000 r/min离心10 min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15 min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。

5、DNA的溶解与保存

在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液（100-200 µl），存放于4 ℃，轻摇溶解过夜。DNA溶液分装后通常4 ℃保存备用，如果需要长期保存，应在-20 ℃以下保存。

（二）、紫外吸收法检测DNA浓度和质量

DNA分子中的嘌呤环和嘧啶环能够很好地吸收260 nm附近的紫外光，因而可以利用紫外吸收的方法测定DNA浓度和质量。1 µg／mL DNA溶液在260 nm波长下的吸光值（OD260）为0.02，当OD260 = 1.0时，样品的浓度则为50 µg／mL。

记录紫外分光光度计上测得的吸光值OD260，按以下公式计算待检DNA样品的浓度：

DNA样品的浓度（µg／mL）=50×OD260值

蛋白质对紫外光吸收的高峰在280 nm处，如果蛋白质清除得比较彻底，则待检DNA样品的OD260／OD280应在1.8左右。如果测得的比值大大低于1.8，则说明样品中还存在着较多的蛋白质，如果测得的比值大大高于1.8，则说明样品中还存在着较多的RNA。

酚对紫外光吸收的高峰在270 nm处，如果测得的OD260／OD270比值在1.2左右，则表明样品中不含酚。

盐和小分子对紫外光吸收的高峰主要集中在230 nm处，OD260／OD230的比值应在0.4-0.5之间，如果比值较高说明有残余的盐存在。

【注意事项】

植物DNA的制备

一、实验目的

学习从植物组织中提取总DNA的原理和技术，掌握常用的不同提取方法，并进一步比较它们的异同点。

二、实验原理

采用液氮冷冻后破碎植物细胞壁的方法破碎细胞。破碎的细胞悬浮于裂解液中，其中含有的离子型表面活性剂SDS能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出；EDTA螯合二价金属离子以抑制DNA酶的活性。再经酚、氯仿、异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀后析出较纯的DNA。

三、实验材料

新鲜或冷冻的植物叶片。

四、实验仪器

高压灭菌锅，研钵，恒温水浴锅，台式高速冷冻离心机

五、试剂配制

1、裂解缓冲液

100 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），20 mmol／L EDTA（pH 8.0），500 mmol／L NaCl，1.5% SDS。

2、TE缓冲液

10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。

六、实验步骤

1、取5 g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末状，做到尽可能研得越细越好。

2、将粉末转移至50 ml离心管中，待液氮蒸发后，加入20 ml裂解缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温20 min。

3、从水浴中取出离心管，加入5 ml 5 mol／L KCl溶液，混匀，水浴20min。

4、将混合物50000 r/min离心20 min，上清液转移到另一50 ml离心管中。

5、加等体积氯仿／异戊醇（24∶1）混匀，12000r／min 离心5min，取上清液。

6、加等体积氯仿，混匀，12000 r／min 离心5 min，取上清液。

7、加入2.5体积预冷的无水乙醇，充分混匀，12000 r／min 离心5 min沉淀DNA。

9、获得的DNA沉淀用75%乙醇以12000 r／min 离心洗涤10 min，重复洗涤2次。

10、离心收回的DNA沉淀室温下自然风干，等乙醇挥发干净，向沉淀中加入500μL TE缓冲液，溶解DNA。

11、植物DNA浓度和质量检测与动物DNA分子的相同。

【注意事项】

DNA分子的纯化

【实验目的】

在了解DNA分子纯化原理和方法的基础上，掌握实验室常用DNA分子纯化方法的操作技术。

【实验原理】

纯化DNA的常用方法是用酚抽提-乙醇沉淀法，适用于普通实验室操作。它通过交替使用苯酚、氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以增加去除蛋白质杂质的效果；氯仿可以去除核酸溶液中的微量酚，还可以加快有机相与液相混合，去除色素和蔗糖；在氯仿中加入少量的异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

【实验材料】

待纯化的DNA溶液。

【实验仪器】

高压灭菌锅，涡旋混匀器，台式高速冷冻离心机

【试剂配制】

1、Tris饱和酚（pH8.0）：氯仿：异戊醇混合液

酚：氯仿：异戊醇按体积比25：24：1配制，现配现用。

2、氯仿：异戊醇混合液

氯仿：异戊醇按体积比24：1配制，现配现用。

3、醋酸钠溶液

配制3 mol／L的醋酸钠溶液，调节pH值至5.2。

4、TE缓冲液

10 mmol／L Tris·HCl（pH 8.0），1 mmol／LEDTA（pH 8.0），配制完成后高压灭菌，4 ℃保存。

【实验步骤】

1、在待纯化的DNA溶液中加等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，然后在涡旋混匀器上充分混匀。

2、将混合物12000 r／min离心10 min后，移取上层含DNA的水相到另一离心管中。如果在水相和有机相交界处有白色沉淀物，则需要重新抽提水相，直到两相交界处无明显沉淀物。

3、向上层水相中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，在涡旋混匀器上充分混匀后12000 r／min离心10 min。

4、移取上层含DNA的水相到另一离心管中，加1／10体积的醋酸钠溶液，充分混匀，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀，于-20 ℃保存30 min。

5、12000 r/min离心5 min，弃上清液；75%的乙醇12000 r/min离心洗涤5 min，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥10-15 min（不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解）。

6、在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液，溶解后在-20 ℃以下长期保存。

【注意事项】

PCR基因扩增

【实验目的】

掌握PCR反应的基本工作原理和实验技术。

【实验原理】

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；②退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的 3 ′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA 可扩增106-109倍。

【实验材料】

模板DNA溶液，4种dNTP，上游引物和下游引物，Taq聚合酶（1 U／µL）。

【实验仪器】

PCR扩增仪，移液器，涡旋混匀器，台式离心机，凝胶电泳系统，紫外检测仪

【试剂配制】

1、10×缓冲液

500 mmol／L KCl，100 mmol／L Tris·HCl（pH 8.3），15 mmol／L MgCl2，0.1% 明胶。 2、4种dNTP混合液

1 mmol／L dATP，1 mmol／L dCTP，1 mmol／L dGTP，1 mmol／L dTTP。

3、上游引物和下游引物

上游引物和下游引物的溶液浓度都是稀释至10 pmol／µL。

4、模板DNA溶液

稀释至100 ng／µL的模板DNA溶液。