线粒体制备及线粒体通透性转换孔检测
上传者：陈以农|上传时间：2015-05-10|密次下载
线粒体制备及线粒体通透性转换孔检测
心肌线粒体的制备
采用差速分级离心法分离线粒体。取上述处理后的心脏置于预冷的匀浆介质 (16ommol/LKCI， 10mmol/LEDTA，0.5%牛血清白蛋白，pH7.4)中尽快剪碎，用组织匀浆机制成10%匀浆，在4℃下，以1000*g离心10min，弃沉淀，上清液于4℃，8000*g离心10min;弃上清液，沉淀用重悬液(320mmol/L蔗糖， l0mmol/LTris一HCI，pH7.4)重悬后再次于4℃， 8000*g离心10min。所得沉淀即为线粒体。线粒体置于重悬液中用考马斯亮兰蛋白测定法测定蛋白含量。
线粒体渗透性转换的检侧
取线粒体用肿胀液 t(120mmol/LKCI，20mmol/LM0pS，10mmol/L Tris一Hcl， 5mmol/LKH2PO4，pH7.4)稀释至0.25g/L蛋白质，于25℃， 200μmol/L的 CaC12作用于线粒体，连续观察520nm处线粒体吸光度(A520)的变化15min，30个循环。该变化反映线粒体肿胀程度，提示MPTP的开放情况。
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