高效液相色谱技术(HPLC)(HPLC详解)Word

　　高效液相色谱技术(HPLC) 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析 速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析 高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是： 价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无 机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋 势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 高 效 液 相 色 谱 ( HPLC:High Performance Liquid Chromatography )是化学、生物化学与分子生物学、医药学、 农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要 的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他 们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。国际市 场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最 大的份额，增长速度最快。

　　7.1 基本原理加样 相 流动相 流动相 固定相 流动

　　A

　　BC

　　C B A

　　固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。

　　HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动 相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的 交换和分配而达到分离的过程。

　　按溶质(样品)在两相分离过程的物理 化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱(体积排阻色谱):—— 分子大小而引起的体积排阻

　　分配色谱又可分为：

　　正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。 用的最多，约占60~70%。 固定相(柱填料): 固定相又分为两类：

　　①一类是使用最多的微粒硅胶；②另一类是使用较少的高分子微球：

　　优点是强度大、化学惰性、使用pH范围大(pH=1~14); 缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和 凝胶色谱。

　　最常使用的全孔微粒硅胶( 3 ~ 10 μm)是化 学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的 80%。它是通过化学反应把某种适当的化学官 能团(例如各种有机硅烷),键合到硅胶表面 上，取代了羟基(- OH)而成。它是近代高 效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。

　　使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是 2 ~ 7.5 ,若过碱( pH8),硅胶会粉碎或溶 解；若过酸( pH1),键合相的化学键会断 裂。有些特殊的健合相可以用于pH 9~11。键合相使用硅胶作基质的优点是： ①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和 表面积易人为控制；③化学稳定性好。

　　硅胶 ( SiO2 n H2O) :

　　OH |

　　OH |

　　—Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合

　　相，它是硅胶与有机硅烷反应的 产物。 最常用的键合相键型是： | | —Si—O—Si—C

　　|| R1 —Si—OH + X—Si—R

　　|| R1 —Si—O—Si—R + HX

　　|硅胶

　　R2有机硅烷

　　|键合相

　　R2

　　X ━ Cl,CH3O,C2H5O等。 R ━ 烷：C8H17(即C8填料),C10H21,C18H37等。 R1 、R2 ━ X、CH3等。

　　最常用的“万能柱”填料为“ C18”,简称“ ODS” 柱，即十八 烷基硅烷键合硅胶填料(Octadecylsilyl,简称 ODS)。这种填料 在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱 70 ~ 80 %的分析任务。由于 C18(ODS) 是长链烷基键合相，有较 高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的 适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来， 为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、 C4等短链烷基键合相和大孔硅胶(20~40μm)。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、 C8、C4等。 ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 -CN氰基、-NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：-SO3H磺酸基、-COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N+季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH=2~7.5的范围内使用，而离 子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚 苯乙烯和二乙烯苯。)

　　流动相：

　　1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋 喃 最常用的流动相组成是：“甲醇 — H2O” 和“乙 腈—H2O”,由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲 醇—H2O”流动相。 2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：

　　正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但 80 %的 顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进 行分离。

　　反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水 性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱 下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响 其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中， 经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟 乙酸(TFA),使用浓度为0.1%,使流动相的pH值为2~3,这 样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使其疏水性增加，延 长洗脱时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的 保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色 谱的原理将一种与样品离子电荷(A+)

　　相反的离子(B-),称 为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性 的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了 保留值，改善了分离效果。

　　流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境。

　　7.2 基本参数1. 保留值进样

　　t0

　　tR⑴保留时间“ tR”:进样至出峰的时间。

　　⑵死时间“ t0”:不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。死时间“ t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫 外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳， 反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。

　　⑶容量因子“ k’ ”:

　　tR-t0 k= t0,ab

　　溶质在固定相中的量 k '= 或： 溶质在流动相中的量

　　“ k’ ”是比“ tR”还常用的保留值，它与柱子 的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动 t -t k= t 相的分配性质、柱温以及相空间比(即固定相 和流动相之体企积比)有关。“ k’ ”又定义为 在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消 除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是 平衡时物质在两相中的浓度比。 k’值的范围： 0.420~30 k’=2~5 为佳，过大则耗时太长。, R 0 0

　　⑷保留体积：VR=tR FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR’= tR-t0 调整保留体积：VR’= VR-VR0=tR’ FC ⑸选择性指标“α’ ”和相对保留值“α” α’ 可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏： 进样 tR(1) tR(2)

　　tR ( 2 ) α '= tR (1)

　　相对保留值α(分离因子):

　　t' R(2) k ' ( 2) α = = t ' R (1) k ' (1)

　　( α1.1为好 )

　　2. 柱效率：

　　tR 定义： 理论塔板数 ： N=

　　2

　　( 每米柱 )2 W1/2

　　—标准偏差，曲线拐点处峰宽的 1/2h 一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 为便于测量，改用半峰宽： W1/2( 或2△t1/2 )1/2h Wb

　　最常用的计算式：

　　另一计算式：2

　　tR N=5.54 W 1/ 2

　　tR N= 16 W b

　　2

　　( Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。)

　　理论塔板高度：

　　经验式： H=2dP ( dP=10μ H=20μ N=5万 ) ( dP=5μ H=10μ N=10万 ) dP—柱填料的颗粒直径 柱效的测定和计算： 以反相柱为例，流动相用 87 % (V/V) 的甲醇 : 水，样品用苯、 联苯、萘等，加快记录仪的走纸速度，测出半峰宽 W1/2,并 由走纸速度换算为与

　　tR 相同的单位 “分” 或 “秒” ,代入 公式，计算出柱效N。 提高柱效的方法： ①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。 ②流动相粘度低。 ③低流速。 ④升高柱温。

　　L( L — 柱长) H= N

　　3. 不对称因子“Tf”:

　　用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。

　　hA B 0.1h

　　进样

　　进样

　　拖尾

　　前伸

　　B ( A、B如上图所示) A 通常 Tf=1.2~1.3 ,若 Tf2 则峰不合格。 峰拖尾的原因是硅胶基质上的Si-OH羟基未被全部键合而与 溶质发生反应。 改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次 对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 – NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。 T f=

　　分辨率：

　　tR(1)

　　tR(2)

　　2(t R 2-t R1 ) RS= tW 1+tW 2

　　进样

　　W1/2(1)

　　W1/2(2)

　　tW1

　　tW2

　　4. 分离度 K1和 K3⑴基线分离度 K1 : ( 基线分离时用K1。)

　　HPLC的目的和要求是：峰要尽可能窄(W1/2小),峰间距大(tR相差大)。

　　K1= W1/ 2( 2)-W1/ 2(1)H h

　　t R ( 2)-t R (1)

　　⑵峰高分离度：

　　H-h K 3= H( K3=1 基线分离，K3 更反映了实际分离度。)

　　5. 线速度：溶剂在柱中移动的速度。

　　L u= t0

　　mm/sec ( L─柱长 t0 ─死时间)H(μm) 粗粒

　　如右图所示，用实验可找到最佳的线速度： 细粒 即图中的A点：u=1 mm/sec 此处不用流量而用线速度，是因为流量与 柱径有关，而线速度与柱径无关。 请记住不同柱内径的最佳流量： A B u(1mm/sec) 柱内径 流量 线速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec ( B奌： u=2 mm/sec ) 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 μL/min 1 mm/sec 由 “1 mm/sec ” 最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。 由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一 个月才用一并。

　　5. 保留值方程：正相色谱： lnk’=a+blnCb+cCb 反相色谱： lnk’=a+cCb 离子交换色谱： lnk’=a+blnCb ( Cb─强冲洗剂浓度 ) ( 对于不同溶质 a、b、c 系数不同 ) ( 反相色谱是线性方程 )正相色谱： lnk’ lnk’ 反相色谱：

　　Cb

　　Cb

　　lnk’四氢呋喃/水 甲醇/水

　　lnk’萘

　　D

　　苯

　　Cb

　　D

　　Cb (甲醇/水)

　　D点：同样的容量因子，四氢呋喃 用量少 lnk’ 甲

　　D点：萘非极性强，k’大，斜率陡

　　lnk’

　　乙 C A B Cb A点甲、乙二溶质分不开，B点比 A A D A Cb A点分不开，要寻找不是交叉点 D点的Cb浓度为分离条件

　　的C点冲洗剂浓度高，但k’小，省时 间，所以选B点好。

　　所以，改变 Cb 浓度，保留值 k’ 和选择性 α 都改 变了，寻找最佳的 Cb 浓度就是 HPLC 高效液相色 谱技术的精髓所在。例如，通常用 10 %~ 90 %的甲醇 / 水，梯度洗 脱30min,即可找出适宜的Cb浓度。

　　用高浓度Cb洗脱，可保证先将所有的峰都

　　洗脱 出来，不丢失组份，然后再调节Cb浓度，找到更 好的分离效果，加大各组份色谱峰的分离度。 甲醇降低10%,k’可降低2~3倍。