洋葱苯丙氨酸解氨酶基因AcPAL2的克隆与表达分析

园艺学报，2015，42 (3)：505–512.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0900；http：//www. ahs. ac. cn 505 洋葱苯丙氨酸解氨酶基因AcPAL2的克隆与表达分析

梁 毅1，刘小义2，张洪伟1,*，谭武平1

（1北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京京研益农科技发展中心，北京100097；2中国质量认证中心，北京100070）

摘 要：利用简并PCR技术和RACE技术克隆得到了一条洋葱的苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因全长

cDNA序列。该cDNA序列全长2 349 bp，编码长685个氨基酸残基的多肽序列，命名为AcPAL2。Blast

分析表明该序列与虎眼万年青Galtonia saundersiae、野蕉Musa balbisiana的相似性均较高。Real-time PCR

表达及花青素含量分析表明，红皮洋葱该基因表达量最大，而黄皮和白皮洋葱表达量极低；在红皮洋葱中

该基因在膨大初期大量表达，并迅速降低至一定程度后趋于相对平稳表达，且与花青素的积累过程相一致。

关键词：洋葱；花青素；AcPAL2；基因表达

中图分类号：S 633.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0505-08

Molecular Cloning and Expression Analysis of AcPAL2 in Onion

LIANG Yi1，LIU Xiao-yi2，ZHANG Hong-wei1,*，and TAN Wu-ping1

（1Beijing Vegetable Research Center of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops in North China，Beijing Jing Yan Yi Nong Sci-Tech Development Center，Beijing 100097，China；2China Quality Certification Center，Beijing 100070，China）

Abstract：A full-length cDNA of phenylalanine ammonia lyase-homologue（AcPAL2）was isolated from onion using degenerate PCR and the RACE（rapid amplification of cDNA ends）method. The full-length cDNA is 2 349 bp long，which encodes a polypeptide of 685 amino acids. Blast analysis indicate that the polypeptide shares a relatively high similarity with Galtonia saundersiae and Musa balbisiana. Real-time PCR analysis demonstrate that AcPAL2 mRNA express abundantly in red onions，but extremely low in yellow and white onions；AcPAL2 in different bulb swelling stage in red onion has a high expression during the initiation，then express stable after a rapid decrease. And anthocyanin content change also shows the same tendency with AcPAL2 expression.

Key words：onion；anthocyanin；AcPAL2；gene expression

植物颜色主要是由类黄酮素（Flavonoids）、类胡萝卜素（Carotenoids）和甜菜碱素（Betalains）的不同分布所决定，其中类黄酮化合物花青素主要决定植物的红色、紫色和蓝色（Field et al.，2001）。 收稿日期：2014–11–28；修回日期：2015–01–26

基金项目：国家公益性行业科技项目（20093018）；‘十二五’国家科技支撑计划项目（2012BAD02B00，2011BAD35B07，2012BAD50G01）；北京市科委育种平台三期项目（D111100001311002）；北京市常规育种财政专项（2014-509）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhwwawzjcx@http://wendang.chazidian.com）

Liang Yi，Liu Xiao-yi，Zhang Hong-we，Tan Wu-ping .

Molecular cloning and expression analysis of AcPAL2 in onion.

506 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：505–512.

花青素的生物合成以苯丙氨酸为直接前体，经历一系列的酶促反应及不同的羟基化、糖基化、甲基

化、酰基化修饰后在液泡中汇集（Holton & Cornish，1995），其中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine

ammonia-lyase，PAL）催化L–苯丙氨酸生成反式肉桂酸，是花青素生物合成反应中的第一个酶，

也是多种次生代谢产物的关键酶和限速酶。

早在1960年，Neish就证实了PAL可以催化花青素的合成（Neish，1960）。用白光、蓝光或红

光照射尾穗苋的黄化苗，可以使PAL活性不同程度上升，并且发现其特有色素苋红素大量积累（应

初衍和薛应龙，1984）；Nakazawa等（2001）研究发现在牵牛花花蕾中，PAL基因转录水平的增加，

会使PAL活性升高，进而使花青素含量也大量增加，说明牵牛花花蕾PAL活性和转录水平均与花

青素积累有关；史宝胜等（2007）认为可以通过增加光照强度来增加紫叶李叶片PAL酶的活性，促

进花青素大量合成而使其叶片迅速呈现红色。另外，还有人通过调节PAL基因的表达模式，有效地

改变了矮牵牛、烟草和菊花等植物的花色。洋葱（Allium cepa L.）根据鳞茎颜色的不同，分为红皮、

黄皮和白皮等不同种类。本研究中以红皮洋葱为试验材料，利用RT-PCR与RACE技术分离并克隆了

1条PAL基因全长cDNA序列，并对其进行部分序列分析，及其表达情况和花青素含量关系的分析，

为明确PAL基因与花青素合成之间的关系提供依据，为进一步探究洋葱花青素的合成途径奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在北京市农林科学院蔬菜研究中心农场种植白皮洋葱品种‘白雪’、红皮洋葱品种‘中生赤玉’

和黄皮洋葱品种‘黄金大玉葱’，常规栽培管理。

于鳞茎开始膨大（2013年4月下旬）后的不同时期采集红皮洋葱鳞茎，于鳞茎开始膨大30 d

时采集红、黄、白皮洋葱鳞茎，采集后立即液氮速冻，保存于–80 ℃，用以提取总RNA。

1.2 基因全长cDNA序列克隆

从NCBI下载洋葱近缘植物（玉米，大蒜，石蒜，小果野蕉，毛竹）的PAL基因序列，根据这

些序列，利用软件Primer Premier 5.0设计简并引物（表1）。

表1 涉及到的引物及其序列

Table 1 Primers involved in the study and its sequences

用途Purpuse 引物名称Primer name 核苷酸序列*（5′→3′）Nucleotide sequence*

中间片段扩增Intermediate fragment amplification PAL-de-F GGHATYCGVTTYGARATCCT

PAL-de-R GTTGTCCATGGANACVCCRAT 全长cDNA 扩增 Full-length cDNA amplification P1FL GAAAAGGAAAGGCCAATTTGTTCATAT

5′-RACE PCR扩增5′-RACE amplification P1R-1 AATCTGACCTGGATGATGTTTC

P1R-2 ACTGCAAGAACATTGGCCTCA Actin内参引物Actin Primers AcActin-S ACACGGCCTGGATAGCAACAT

AcActin-A AGAGCAGTATTCCCAAGCATT Real-time PCR引物Specific primer for real-time PCR P1-S GGGCAACTTCGCATAGGAGG

P1-A GCTGTTCAAGAAAGCGGCAA

* H = A/T/C；V = G/A/C；R = A/G；Y = C/T；N = A/T/C/G。

以开始膨大30 d后的红皮洋葱鳞茎作为试验材料，使用试剂TotalRNAExtractor（Trizol）（上海

生工）提取总RNA，PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）合成cDNA第一链，以

简并引物PAL-de-F和PAL-de-R扩增PAL基因。

梁 毅，刘小义，张洪伟，谭武平.

洋葱苯丙氨酸解氨酶基因AcPAL2的克隆与表达分析.

园艺学报，2015，42 (3)：505–512. 507

扩增体系为：10 × LA PCR BufferⅡ（Mg2+ Plus）2.0 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol · L-1）3.2 μL，PAL-de-F（50 μmol · L-1）1.0 μL，PAL-de-R（50 μmol · L-1）1.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，TaKaRa LA Taq（5 U · μL-1）0.2 μL，加水补足20 μL。

反应条件为：94 ℃ 3 min；然后94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。凝胶电泳检测PCR结果，将目的条带切下并使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0（TaKaRa）回收目的片段，将回收的DNA片段连接在载体pMD18-T Vector（TaKaRa）上，并转化大肠杆菌JM109（TaKaRa）。经PCR鉴定和酶切鉴定后挑选合适的重组质粒克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

使用软件Primer Premier 5.0和上述克隆得到的片段序列设计5′-RACE特异引物P1R-1和P1R-2，利用5′-Full RACE Kit（TaKaRa）进行嵌套PCR反应以获得目的基因的5′–末端序列。利用5′–末端序列设计引物P1FL，按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书操作，进行PCR反应，并经回收、连接、转化、重组质粒鉴定及测序后得到全长cDNA序列。

1.3 序列的生物信息学分析

ORF查找和核苷酸翻译等使用软件Vector NTI；蛋白质分子量和pH值预测使用ProtParam（http：// web. expasy. org/ protparam/）；N–端信号肽序列预测使用Signal4.1（http：//www. cbs. dtu. dk/ services/ SignalP/）；序列的同源比对和结构域预测使用BLAST program（http：//www.ncbi.nlm. nib. gov/ blast），序列多重比对使用Clustal W（www.ebi. ac. uk/ clustalw/）；部分植物PAL蛋白质和AcPAL2的系统进化分析使用Mega4.1软件，以N-J算法，重复抽样1 000次来进行。

1.4 基于Real-time PCR的基因表达分析

以膨大开始后10、20、30和40 d的红皮洋葱‘中生赤玉’鳞茎为材料，分析AcPAL2基因在洋葱鳞茎膨大不同时期的表达变化情况。以膨大开始30 d的红、黄、白皮洋葱（‘中生赤玉’、‘黄金大玉葱’、‘白雪’）鳞茎为材料，分析AcPAL2基因在不同皮色洋葱鳞茎中的表达情况。

以洋葱β-Actin基因（引物为AcActin-S和AcActin-A）作为内参，使用引物P1-S、P1-A和试剂RealMasterMix（SYBR Green）（TaKaRa），在Light Cycler system（Roche LightCycler480实时荧光

。 定量PCR仪）上进行Real-time PCR，数据分析采用2-ΔΔCT法（Livak & Schmittgen，2001）

1.5 花青素含量分析

取膨大开始30 d的红、黄、白皮洋葱（‘中生赤玉’、‘黄金大玉葱’、‘白雪’），以及膨大10、20、30和40 d的红皮洋葱‘中生赤玉’鳞茎各1.0 g，充分研磨后加入10 mL预冷的0.005%盐酸—甲醇溶液，4 ℃避光静置12 h；收集上清液，残渣再次以10 mL预冷的0.005%盐酸—甲醇溶液处理6 h，合并上清液并定容。按体积比1︰4分别将上述溶液与0.4 mol · L-1 KCl-HCl缓冲液（pH 1.0）和NaAc缓冲液（pH 4.5）混合，室温静置20 min，分光光度计检测530 nm和700 nm吸光值。花青素含量的计算参照杨兆艳（2007）所述pH示差法。

2 结果与分析

2.1 AcPAL2 cDNA的克隆和序列分析

以开始膨大30 d的红皮洋葱鳞茎为试验材料，经RNA提取、反转录、简并PCR扩增获得了1个717 bp的片段（图1，A）。

Liang Yi，Liu Xiao-yi，Zhang Hong-we，Tan Wu-ping .

Molecular cloning and expression analysis of AcPAL2 in onion.

508 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：505–512.

Blast分析表明该片段与葡萄、烟草、枸杞PAL基因的相似性均较高，故将其命名为AcPAL2。利用该片段序列设计引物，通过5′–RACE技术克隆得到该cDNA的5′–末端（图1，B）。

根据5′–末端序列设计引物，利用3′-RACE技术得到该基因的完整cDNA序列（图1，C，GenBank登录号KF421111.1）。

图1 AcPAL2 cDNA中间片断（A）、5′-RACE（B）和全长cDNA片断（C）的扩增

Fig. 1 PCR amplification of AcPAL2 cDNA intermediate fragment（A），5′-RACE（B）and full-length fragment（C）

序列分析（图2）发现，该基因cDNA全长2 349 bp，其中ORF序列长2 055 bp，编码由685个氨基酸残基组成的蛋白质多肽，5′-UTR长度为94 bp，而3′-UTR序列长度为200 bp（包含长度为12 bp的polyA尾巴）。

图2 AcPAL2 cDNA序列及其推导的氨基酸序列

阴影标注起始密码子ATG和终止密码子TAG，下划线部分为PAL酶特征序列。

Fig. 2 AcPAL2 cDNA nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence

The ATG start codon and TAG stop codon is marked in shade，and the PAL feature sequence is marked underlined.

梁 毅，刘小义，张洪伟，谭武平.

洋葱苯丙氨酸解氨酶基因AcPAL2的克隆与表达分析.

园艺学报，2015，42 (3)：505–512. 509

Blastp分析表明，该序列与虎眼万年青Galtonia saundersiae（AHG06396.1）、野蕉Musa balbisiana（BAG70992.1）的相似性分别为82%和79%，包含保守结构域PAL-HAL和PLN02457，以及苯丙氨酸解氨酶的酶活性中心特征序列（GTITASGDLVPLSYIA），是Lyase_I_like 家族成员之一。

Signal4.1分析表明该基因编码的蛋白质不含信号肽序列，是一种非分泌蛋白。而protparam tool分析预测发现该多肽分子量为74.76 kD，理论pI值为6.39。

2.2 AcPAL2蛋白系统进化分析

为了研究AcPAL2蛋白和其它物种PAL蛋白质之间的进化关系，从网上下载部分植物的PAL蛋白质序列，及克隆得到的另一个洋葱PAL基因产物AcPAL1（梁毅 等，2014）进行多重序列比对，并构建PAL蛋白的系统进化树。如图3所示，植物亲缘关系较近的PAL蛋白趋于分布在同一分支中，如属于蔷薇科植物的西洋梨、苹果和李在同一分支，豆科植物菜豆、大豆和豌豆也分在同一分支，玉米、小麦、白绿竹、毛竹等禾本科植物PAL蛋白同样聚为一个分支。本试验获得的AcPAL2蛋白与虎眼万年青PAL蛋白聚为同一个分支，与野蕉PAL蛋白的亲缘关系也较近，但是和同属植物大蒜的PAL蛋白亲缘关系却相对较远，而AcPAL1基因产物的进化与洋葱分类地位更加符合，这可能是由于对洋葱近缘植物PAL基因研究较少，且该基因家族普遍由小的多基因家族构成而导致的。

图3 AcPAL2及其他植物PAL蛋白构建的系统进化树

Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by AcPAL2 and other PALs

2.3 AcPAL2表达及与花青素含量关系分析

为研究AcPAL2基因对不同皮色洋葱花青素积累及生长发育过程中花青素含量变化的影响，分别以开始膨大30 d的白、黄、红皮洋葱（‘白雪’、‘黄金大玉葱’、‘中生赤玉’）鳞茎和开始膨大10、20、30、40 d的红皮洋葱‘中生赤玉’鳞茎为试验材料，利用Real-time PCR研究了AcPAL2基因的表达情况，并对这些材料的花青素含量进行分析。如图4所示，膨大30 d的红皮洋葱鳞茎AcPAL2大量表达，白皮和黄皮洋葱表达量极低；而红皮洋葱花青素的含量远远高于黄皮和白皮洋葱。

对膨大不同时间红皮洋葱鳞茎基因表达的分析（图5）发现，鳞茎刚开始膨大时，AcPAL2大量表达，并随鳞茎膨大的过程迅速降低，至膨大20 d时该基因表达量已经极低且继续缓慢降低，这与