柑橘CHS基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响

园艺学报，2015，42 (3)：435–444.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1036；http：//www. ahs. ac. cn 435 柑橘CHS基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响

王志彬，申晚霞，朱世平，薛 杨，赵晓春*

（中国农业科学院/西南大学柑桔研究所，国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）

摘 要：查尔酮的合成是类黄酮生物合成途径中的一个关键节点。从10个柑橘种质中克隆了查尔酮

合成酶（chalcone synthase，CHS）基因，并对其不同时期的果实和叶片中的类黄酮含量进行了测定，分

析了CHS基因的序列多态性与类黄酮含量之间的关系；同时通过qRT-PCR检测了CHS基因在不同种质

之间以及同一种质的不同组织间的表达差异。结果表明，柑橘CHS基因的核苷酸序列高度保守，相似度

达98%以上。聚类分析表明，CHS氨基酸序列的多态性有物种特异性，而且与类黄酮含量有一定的相关

性。CHS基因的表达水平在不同种质、部位及生长发育时期有显著差异，这些差异与类黄酮的含量有显

著的相关性，说明CHS基因对类黄酮的生物合成有明显影响。

关键词：柑橘；类黄酮；查尔酮合成酶；多态性；差异表达

中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0435-10

Polymorphism and Expression of Chalcone Synthase Gene in Citrus Related to the Flavonoids Content

WANG Zhi-bin，SHEN Wan-xia，ZHU Shi-ping，XUE Yang，and ZHAO Xiao-chun*

（Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Southwest University，National Engineering Research Center for Citrus，Chongqing 400712，China）

Abstract：Chalcone synthase is one of the most important enzymes in flavonoids biosynthesis pathway. In this study，the CHS genes encoding chalcone synthase were isolated from 10 citrus species. Their expressions in different parts of plant and different time of the development were analysed by qRT-PCR. The flavonoids content at different development stages of fruits and leaves were investigated. The results indicated that in different citrus species，the CHS genes are very conservative with a high level of similarity at 98%. However，polymorphism on amino acid sequence of CHS was found among different citrus species，which demonstrated certain relationship with flavonoids content. The study reveals that expression level of CHS genes significantly different among different species，part of plant and development stages，indicating the CHS gene plays an important role in the biosynthesis of flavonoids in citrus.

收稿日期：2014–12–01；修回日期：2015–02–12

基金项目：中央高校基本业务费专项资金项目（XDJK2014D032，XDJK2014C024）；重庆市研究生科研创新项目（CYS14045）；国家自然科学基金项目（31101521）；现代农业产业技术体系项目（CAR-27）；国家果树种质重庆柑桔圃项目

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhaoxiaochun@http://wendang.chazidian.com）

Wang Zhi-bin，Shen Wan-xia，Zhu Shi-ping，Xue Yang，Zhao Xiao-chun.

Polymorphism and expression of chalcone synthase gene in citrus related to the flavonoids content.

436 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：435–444.

Key words：citrus；flavonoids；chalcone synthase；polymorphism；differential expression

甜橙、酸橙、柠檬、枸橼、宽皮柑橘和葡萄柚等柑橘类植物的果实、树皮、树叶、花及根中广泛存在类黄酮物质（叶兴乾 等，2008）。迄今为止，从柑橘中鉴定出的类黄酮超过了60种，包括黄酮、黄烷酮，以及主要存在于血橙中的花青苷和主要存在于柠檬中的黄酮醇（Di Majo et al.，2005；Tripoli et al.，2007）等，它们均具有重要的生物活性（Tarahovsky et al.，2014），如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、清除自由基和保护心脑血管等（Middleton et al.，2000；Akhlaghi & Bandy，2009）。而且，类黄酮与植物的抗逆性密切相关，在抵抗逆境胁迫中发挥重要作用（Treutter，2006；宴校，2011）。

不同柑橘种质，以及植株的不同组织部位的类黄酮含量存在很大的差异。查尔酮是合成各种类黄酮的基本骨架，查尔酮的合成处于类黄酮生物合成途径的上游。查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶，它催化3分子的丙二酰–CoA和1分子的对香豆酰–CoA结合形成查尔酮。因此，CHS酶催化的反应是整个类黄酮合成途径的重要限速步骤（Shih et al.，2008；Wang et al.，2010）。第一个CHS基因是从紫外线辐射处理的欧芹悬浮培养细胞中分离获得的（Reimold et al.，1983），目前已报道的CHS基因序列超过4 000条，来自19个科，涉及苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物（杨继和顾红雅，2006；李莉 等，2007；周兴文 等，2011；康亚兰 等，2014），但在柑橘中的报道尚少，未见对其在不同柑橘种质中的等位基因数量、功能差异及基因表达活性等的报道。

本研究拟克隆不同柑橘种质的CHS基因，以分析其序列在不同柑橘种质间的差异，同时分析CHS基因在不同种质、不同组织部位的表达水平以及类黄酮的含量，研究柑橘CHS基因与类黄酮合成之间的相关性，探索类黄酮生物合成途径中关键基因的遗传调控机制，为通过遗传改良技术调控柑橘次生代谢产物合成途径，提高类黄酮的产量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及取样

试验材料全部来自国家果树种质（重庆）柑橘圃。2012年对北京柠檬[Citrus limon（L.）Burm. f.‘Meyer Lemon’]、枳柚（C. paradisi Macf. × Poncirus trifoliata L. Raf.）、宜昌橙（C. ichangensis Swingle‘Ichang Papeda’）、塔罗科血橙[C. sinensis（L.）Osbeck‘Tarroco’]、粉红汤姆逊葡萄柚（C. paradisi Macf.‘Pink Thompson’）、梁平柚[C. grandis（L.）Osbeck‘Liangpingyou’]、大坑野橘（C. daoxianensis S. W. He）、澳指檬杂种（C. reticulata Blanco）、广西凭祥土柠檬（C. limonia Osbeck ‘Guangxipingxiang’）和巴西酸橙（C. aurantium L.‘Brazil Sour Orange’）10个种质分别于7月、9月和生理成熟期采集果实。2014年5月7日，采集上述10个种质同一植株上成熟叶与幼叶（约50%伸展度）；同年5月23日、6月19日、7月24日、8月29日、9月29日和10月27日分别采集北京柠檬的果实；6月19日、7月24日、8月29日、9月29日和10月27日分别采集塔罗科血橙的果实。

叶片和果实的采样方法为：天气晴朗的条件下，随机选取生长健壮的植株，按东西南北4个方向采取适量样品立即置于液氮中速冻，于–80 ℃下保存备用。不同组织部位的材料采集方法为：随机选取生长健壮的植株，按东西南北4个方向分别取适量主根韧皮部，主茎韧皮部和幼茎韧皮部，立即置于液氮中速冻，于–80 ℃下保存备用。

王志彬，申晚霞，朱世平，薛 杨，赵晓春.

柑橘CHS基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响.

园艺学报，2015，42 (3)：435–444. 437

1.2 类黄酮含量检测

委托农业部柑橘及苗木质量监督检验测试中心（重庆），采用冉玥等（2013）报道的方法检测圣草枸橼苷（eriocitrin）、芦丁（rutin）、芸香柚皮苷（ruenaringin）、柚皮苷（naringin）、橙皮苷（hesperidin）、新橙皮苷（neohesperidin）、香风草苷（didymin）、柚皮素（narirutin）、橙皮素（hesperitin）、甜橙黄酮（sinensetin）、川皮苷（nobiletin）、橘黄酮（tangeretin）等12种柑橘主要类黄酮的含量。含量用mg · g -1 FW表示，FW（fresh weight）为鲜质量。 1.3 CHS基因的克隆与生物信息学分析

使用植物总RNA抽提试剂盒（Tiangen，北京）从10个不同种质的幼嫩叶片中提取总RNA，以总RNA为模板，使用反转录试剂盒（Promega，北京）和APdT引物（表1）经反转录获得cDNA。使用特异引物通过PCR扩增获得cDNA序列片段，经克隆测序拼接后得到CHS基因的mRNA的全长序列。使用植物总DNA抽提试剂盒（Tiangen，北京）提取北京柠檬基因组DNA，使用位于ORF两端的引物（CHSF3、CHSR3）对基因组CHS基因进行PCR扩增，获得CHS的基因组DNA片段。，所有测序由华PCR反应所用的酶为PrimeSTAR® Max DNA Polymerase高保真酶（TaKaRa，大连）大基因和上海生工完成，每个序列各测3个重复。

利用Vector NTI Advance 11对10个种质的CHS基因进行序列比对；BioXM 2.6软件推导其氨基酸序列；在线软件Prot Param（http：//http://wendang.chazidian.com）预测编码蛋白的分子量和等电点；TMHMM 2.0在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk）分析跨膜结构域；SignalP Server在线软件（http：// www.cbs.dtu.dk）预测信号肽；PDB预测蛋白的二级结构；使用MEGA软件对编码区氨基酸序列进行聚类分析。

1.4 CHS基因的表达量分析

以β-actin为内参基因，以Wang等（2010）报道的实时定量引物CHSq F1和CHSq R1做实时荧光定量PCR，分别检测CHS基因在10份不同种质的老叶和幼叶，北京柠檬5个不同组织、部位以及北京柠檬和塔罗科血橙果实成熟过程中果皮中的表达情况，其中幼嫩叶片中的表达以巴西酸橙为1，成熟叶片以粉红汤姆逊葡萄柚为1，北京柠檬5个不同组织以嫩叶为1，塔罗科血橙和北京柠檬不同发育时期果皮中的表达分别以6月19日果皮和5月23日果皮为1。本试验所使用的引物的信息见表1。

表1 试验中用到的引物 Table 1 Primers used in this study

引物 Primer

CHSq F1；CHSq R1 CHS F3；CHS R3 CHS F4；CHS R4 CHS F5；CHS R5 CHS F6；CHS R6 β-actin F；β-actin R

序列

Sequence（5′–3′）

产物长度/bp Product size

退火温度/℃

Annealing temperature 60 55 55 55 60

AP dT primer* GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT

CGGAGATCACGGCAGTCATCT；CAGCACCATCACCGAACAAA 87 CCAAGCACGAGCCACAAACA；ACAAACACCGAGCACGAACC 1 240 GGCGTCGACATGCCCGGC；ACCGGGGTGAGCGATCCAG 479 ACAAGTCAATGATTAAGAAG；GCAGCAGCACCATCACCG CCAAGCAGCATGAAGATCAA；ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG

452 101

CTGGATCGCTCACCCCGG；GACCTTTGGGCATTTACAG 505 55

注：*为cDNA反转录第一链的接头引物。

Note：*Adaptor PolyA Primer used in reverse transcription for the synthesis of first strand of cDNA.

Wang Zhi-bin，Shen Wan-xia，Zhu Shi-ping，Xue Yang，Zhao Xiao-chun.

Polymorphism and expression of chalcone synthase gene in citrus related to the flavonoids content.

438 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：435–444.

2 结果与分析

2.1 不同柑橘种质中CHS基因的克隆与序列分析

从10个柑橘种质中克隆获得了CHS基因的cds序列，并提交到GenBank（Accession Number：KP720583 ~ 720592）。获得1 313 bp的CHS基因的cDNA片段，包含完整的开放阅读框（1 173 bp），编码391个氨基酸。序列比对发现10个柑橘种质的CHS基因与已报道的3个柑橘品种的CHS基因编码区核苷酸序列相似度高达98%以上，但在7个核苷酸位点存在差异，并编码不同的氨基酸（表2）。

表2 不同柑橘种质CHS基因的核苷酸及其所编码的氨基酸序列的差异

Table 2 The difference on nucleotide and amino acid sequences of CHS among different citrus species

编号 种质名称 Code Species

核苷酸/氨基酸差异位点/bp

The location of variable site on nucleotide/amino acid sequences

442 ~ 444 CTC/LeuCTC/LeuCTC/LeuCTC/LeuCTC/LeuCTC/LeuCTC/Leu

868 ~ 870CTT/LeuCTT/LeuCTT/ LeuCTT/LeuValValVal

886 ~ 888ACT/AsnACT/AsnACT/ Asn ACT/AsnSerACT/AsnACT/Asn

961 ~ 963 1012 ~ 1014 1060 ~ 1062AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala AGG/Glu TCA/Ser GCT/Ala AGG/ Glu Pro GCT/Ala AGG/Glu TCA/Ser AGG/Glu TCA/Ser AGG/Glu TCA/Ser AGG/Glu TCA/Ser AGG/Glu TCA/Ser GGG/Gly TCA/Ser GGG/Gly TCA/Ser AGG/Glu TCA/Ser Gly TCA/Ser

GCT/Ala GCT/Ala GCT/Ala GCT/Ala GCT/Ala GTT/Val GTT/Val GCT/Ala GVal

16 ~ 18

1 北京柠檬C. limon（L.）Burm. f.‘Meyer Lemon’GAG/Glu2 枳柚C. paradisi Macf. × Poncirus trifoliata L. Raf. GAG/Glu3* 温州蜜柑‘国庆4号’ GAG/Glu

C. unshiu Marcow‘Guoqing 4’

4 宜昌橙C. ichangensis Swingle‘Ichang Papeda’ GAAsp5* 柚‘冯威’C. maxima‘Fengwei’ GAG/Glu6 塔罗科血橙C. sinensis（L.）Osbeck‘Tarroco’ GAG/Glu7 粉红汤姆逊葡萄柚 GAG/Glu

C. paradisi Macf.‘Pink Thompson’

8 梁平柚C. grandis（L.）Osbeck‘Liangpingyou’GAG/Glu9 大坑野橘C. daoxianensis S. W. He GAG/Glu10 澳指檬杂种C. reticulata Blanco GAG/Glu*

11 甜橙‘红宝石’C. sinensis‘Ruby’ GAG/Glu12 广西凭祥土柠檬 GAG/Glu

C. limonia Osbeck‘Guangxipingxiang’ 13 巴西酸橙 GAG/Glu

C. aurantium L.‘Brazil Sour Orange’

CTC/LeuCTT/Val ACT/AsnCTC/LeuCTT/LeuACT/AsnATC/Ile CTT/LeuACT/AsnCTC/LeuGTT/ValACT/AsnIle CTT/LeuACT/AsnIle

CTits codedACT/AsnT/Leu

Gly TCA/Ser GVal

注：单核苷酸在CHS基因cDNA序列中所处位置从起始密码ATG算起；* CHS序列来自NCBI。黑体下划线代表突变的核苷酸，斜体代表由核苷酸差异引起的氨基酸变化。

Note：The location of single nucleotide in CHS mRNA sequence is counted from ATG. * The CHS gene sequences are derived from NCBI. The bold letters inunderline and italics indicate the mutation of nucleotide and corresponding amino acid，respectively.

生物信息学分析发现，柑橘查尔酮合成酶的不稳定系数介于34.25 ~ 35.95之间，属于相对稳定的疏水蛋白且均无跨膜结构域和信号肽（表3），据此推测查尔酮合成酶在游离核糖体上合成后不经蛋白转运，直接在细胞质基质的特定部位行使催化功能。

聚类分析（图1）显示，13个柑橘种质（包括3个已报道的种质）的CHS基因可被聚为两大类，梁平柚、‘冯威’柚和粉红汤姆逊葡萄柚等3个柚类种质有较为相近的CHS mRNA序列，表现出了一定的物种特异性和遗传进化关系。

用引物CHS F3和CHS R3从北京柠檬的基因组DNA中克隆得到了一个长度为1 225 bp的CHS片段，其中发现了一个内含子，长度为102 bp，与cDNA比对发现其剪接位点不符合5′-GT…AG-3′的剪接方式，因此，此柑橘CHS基因的内含子为非Ⅱ型剪接内含子（徐德立和赵小立，2003）。

通过SWISS-MODEL（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk）预测了10个柑橘种质中查尔酮合成酶的二级结构，发现有4个变异的氨基酸位点（16 ~ 18 bp、442 ~ 444 bp、961 ~ 963 bp和1 060 ~ 1 062 bp）出现在α螺旋上，另外3个均不在任何结构域上；同时，在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）

王志彬，申晚霞，朱世平，薛 杨，赵晓春.

柑橘CHS基因序列多态性及表达水平对类黄酮生物合成的影响.

园艺学报，2015，42 (3)：435–444. 439

上查找‘国庆4号’温州蜜柑（Wang et al.，2010）查尔酮合成酶的活性位点注释，以‘国庆4号’查尔酮合成酶（GenBank：ACQ41890.1）为模板，通过逐一筛查，发现突变的位点均不分布在活性位点上。

表3 柑橘13个种质查尔酮合成酶的化学性质 Table 3 Chemical characters of CHS from 13 citrus species

编号 品种名称 Code Species 1 2

*

分子量 不稳定系数总平均疏水指数 Molecular Instability Grand average of mass index（II）hydropathicity

35.49 35.49 35.49

42 636.1 42 646.2

理论等 跨膜结构域和信号肽

电点 Transmembrane domain pI and signal peptide

北京柠檬C. limon（L.）Burm. f.‘Meyer Lemon’42 636.1 枳柚C. paradisi Macf. × Poncirus trifoliata L. Raf.

–0.098 6.28 无No –0.098 6.28 无No –0.101 6.28 无No –0.098 6.28 无No –0.097 6.28 无No –0.097 6.28 无No –0.097 6.28 无No –0.084 6.47 无No

3 温州蜜柑‘国庆4号’

C. unshiu Marcow‘Guoqing 4’ 4

*

宜昌橙C. ichangensis Swingle‘Ichang Papeda’ 42 622.1 35.00 塔罗科血橙C. sinensis（L.）Osbeck‘Tarroco’ 42 622.1 35.77 粉红汤姆逊葡萄柚

C. paradisi Macf.‘Pink Thompson’ 大坑野橘C. daoxianensis S. W. He

42 622.1

35.77

5 柚‘冯威’C. maxima‘Fengwei’ 42 595.1 35.95 –0.091 6.28 无No 6 7 8 9 10

*

梁平柚C. grandis（L.）Osbeck‘Liangpingyou’ 42 622.1 35.77

42 592.1

34.25

澳指檬杂种C. reticulata Blanco 42 592.1 34.25 –0.083 6.47 无No 广西凭祥土柠檬

C. limonia Osbeck‘Guangxipingxiang’

42 592.1

34.25

–0.083 6.47 无No –0.083 6.47 无No

11 甜橙‘红宝石’C. sinensis‘Ruby’ 42 592.1 34.25 –0.083 6.47 无No 12 13

巴西酸橙C. aurantium L.‘Brazil Sour Orange’ 42 592.1 34.25 注：* CHS序列来自NCBI。

Note：* The CHS gene sequences are derived from NCBI.

图1 基于13个柑橘种质的CHS基因ORF所编码蛋白的聚类分析

*为已报道的柑橘CHS基因。

Fig. 1 Clustering analysis of CHS from 13 citrus species *Those citrus CHS cDNA sequences are derived from published database.

2.2 CHS基因在北京柠檬不同组织中的表达及对类黄酮合成的影响

柠檬是果皮和果汁兼用的果品，用途极为广泛。图2为北京柠檬不同组织和器官中类黄酮含量的检测结果。可以看出，不同组织和器官中的类黄酮含量差异显著，根中的类黄酮含量最低（2.74

mg · g-1 FW），嫩叶中类黄酮含量最高（11.90 mg · g-1 FW），两者相差4.3倍，类黄酮含量由低至高

依次为根、主茎、幼茎、幼果和嫩叶，表现出明显的组织特异性。