凉水、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的RAPD分析
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凉水、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的RAPD分析
第25卷第2期
V01.25
No.2
植物研究
2005年4月
April,
2005
BULLETINOFBOTANICALRESEARCH
凉水、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的RAPD分析
口1=I建洲
吴隆坤
刘德利
李
岩
裴
赢
张恒庆4
(辽宁师范大学生命科学学院,大连116029)
摘要采用了RAPD分子标记技术分析了凉水和丰林国家自然保护区红松(Pinuskoraiensis)居
群的遗传多样性。10个随机引物检测到61个可重复的位点,多态位点比率为0.6935。Nei指数统计结果表明,红松的遗传多样性凉水居群(0.2634)大于丰林居群(0.2607)。对比分析了这两个天然红松居群的遗传多样性变化,红松种内的遗传变异主要存在于居群内,居群间存在一定的遗传分化。
关键词红松;遗传多样性;RAPD
ComparisonofgeneticdiversityofPinuskoraiensisintwonationalnature
reserves
byRAPDmarker
LIYan
PEIYing
ZHANG
1
LUJian.ZhouWULong—Kun
LIUDe-Li
Heng—Qing+
(CollegeofLifeScience,LiaoningNormalUniversity,Dalian16029)
Abstract
WithRAPDmethod.thepaperstudiedgeneticdiversityanddifferentiationof
twonatural
populationsofPinuskoraiensisinLiangshuiNationalNatureReserveandFenglinNationalNatureRe—serve.ThroughtheamplificationofRAPDwith10randomprimers,61repeatablelociweredetected,intheamplificationandpercentageofpolymophiclociwas0.6935%.Nei’SindexshowedthelevelsofgeneticdiversityofLiangshui
population(0.2634)washigherthanFenglin’(0.2607);genetic
varia—
tionexistedmainlywithinpopulations,therewerelittlegeneticdifferentiationbetweenpopulations.Keywords
Pinuskoraiensis;geneticdiversity;RAPD
红松林在中国分布于长白山、张广才岭、完达
山和小兴安岭的低山和丘陵地带,是我国东北东部山区地带性顶级群落。百年前天然红松阔叶林曾是覆盖东北山区最主要的植被类型,但是由于上个世纪人类的大规模采伐,绝大部分的红松遭到破坏,使得红松的天然分布区域逐渐缩小。
RAPD技术是1990年由Williams和Welsh首先提出的。1J,该技术利用一个随机的寡核苷酸引物,通常是10个核苷酸,以生物的基因组DNA作模板进行PCR扩增反应,经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。20世纪90年代以来
RAPD标记广泛应用于动植物遗传育种、基因诊断、种群遗传学、生物系统与进化的研究。早在1991年Sederoff等用RAPD标记构建了火炬松
(Pinustaeda)具有200个RAPD位点的遗传图谱【2o;Mosseler等用RAPD标记确认了濒危松属植物(Pinuspine)低水平的遗传多样性[3j。随后欧洲赤松(Pinussylvestris)M-6],白云杉和恩氏云杉(Pi—
cea
glauca和P.engelmannii)一J,辐射松(Pinus
ra—
diata)旧。,银杉(Cathayaargyrophrlla)[93,红松(用一nl/,¥koraiensis)u究。
0’11
o等树种相继进行了RAPD研
基金项目:国家自然科学基金(30170176)资助项目
第一作者简介:吕建洲(1957一),男,副教授,主要从事植物保护工作研究工作。女通讯作者Author
for
correspondence
E-mail:hengqingzhang@163.eom
收稿日期:2004—08—07
万方数据
2期吕建洲等:凉水、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的RAPD分析
本研究用RAPD分子标记技术,对中国东北地海拔280—683m,为坡状的低山丘陵地和宽广谷区的凉水和丰林两个国家级自然保护区内的天然地,丰林河及汤旺河的支流贯穿全区;该保护区主红松(Pinuskoraiensis)居群进行了遗传多样性、遗要保护对象为原始红松母树林。由于保护区地形传结构研究,为合理地保护、利用与开发红松遗传和保护目标的差异,目前这两个保护区内的林型也资源提供可靠的科学依据。有很大的差异。
1实验材料和方法采样时分单株取样,个体的间距大于500m,
取当年生幼叶,所有样品均采自150年树龄以上的
1.1实验材料成年树,其中凉水自然保护区样本数为40个,丰林
样本于2002年6月采自位于黑龙江省的凉自然保护区的样本数为34个。采集的针叶用塑料水、丰林两个国家级自然保护区的天然红松林。这袋装好,于0~4。C条件下带回实验室,超低温冰箱两个自然保护区都位于小兴安岭的南坡,是我国目保存,用于提取DNA。
前保存下来最为典型和完整的原生红松针阔叶混1.2实验方法
交林分布区之一,也是中国和亚洲东北部很具代表1.2.1DNA的提取
性的温带原始红松针阔叶混交林区。凉水国家自采用前:艾_1训方法提取红松总DNA。DNA溶然保护区本区地处小兴安岭南坡达里带岭支脉的于0.1×TE缓冲液,琼脂糖凝胶电泳后,用美国冷东坡,海拔高度在280—707m之间,为典型的低山泉港P41G型凝胶成像系统照相,采用GelPr032丘陵地貌;该保护区的主要保护对象是以红松为主软件对比样品条带与DL2000分子量标准的亮度的温带针阔叶混交林生态系统统。丰林国家自然测定DNA浓度,用于PCR反应的模板用双蒸水稀保护区本区地处小兴安岭南坡,保护区地形平缓,释后备用。
表1用于红松RAPD分析的随机引物及序列
Table1RandomoligonucleotidepfimersandsequencesforP.koraiensisRAPD
1.2.2引物的筛选差。
RAPD引物采用UBC的ConiferKitPrimers试PCR扩增试剂购自宝生物工程(大连)有限公剂盒,经预备试验选择扩增产物稳定、重复性好的司,反应在ThermoElectronCorporation公司生产的引物对所有个体的总DNA进行扩增,从50个检测Px2热循环仪中进行。
引物中共筛选出10个引物,引物的序列见表1。1.2.4扩增产物的检测
1.2.3红松RAPD的反应体系采用水平板琼脂糖凝胶电泳技术,检测PCR
RAPD参照张恒庆等的方法‘12;,经5次重复扩增结果。CEo.5xTBE电泳缓冲液中,凝胶浓度实验优化后确定反应体系如下:总体积20灿,包括为1.2%,以DL2000作为分子量标准,进行稳压电30ng基因组DNA,15ng随机引物,125斗mol/L泳,电压3V/cm,电泳结束后,用美国冷泉港P41GdNTP混合物,lUTaqDNA聚合酶,2.0mmol/L型凝胶成像系统照相,记录实验结果。只记录那MgCl,。反应程序为:94℃预变性5rain;35次热循些电泳谱带清晰,并能在重复实验中稳定出现的环,条件为94℃、1rain,36℃、1rain,72cC、2min;位点。根据各条带的迁移率及带的有无,记录位点最后在72℃下延伸7min。RAPD每次反应均设一带的出现与否,有带记为1,无带记为0,与对照反空白对照,以无菌ddH:O代替模板,以排除系统误应产物具有相同迁移率的带作为污染带,不予记
万 方数据
植物研究25卷
录。态位点比率(P)、Nei基因多样性指数(H)和遗传1.2.5数据统计分析分化系数(GST)。
在RAPD分析中,电泳图谱中的每一条带作
为一个分子标记(molecular2实验结果
marker),它代表了模
板上与引物互补的一对结合位点(10cus),在本实实验对凉水和丰林两个居群的74个红松个体验条件下,迁移率相同的谱带视为同源位点。个体的总DNA进行了RAPD分析。每个引物检{!见0到间多态性主要是由于模板上两个或其中一个与引的位点数在2~11个之间,各位点的DNA片段长物结合的位点发生碱基序列变异,表现为某一特定度介于250~2100bp之间,共检测到61个位点,扩增带的有或无;另一个产生多态的原因是模板上平均每个引物检、狈0到6.1个位点。
与引物互补位点之间插入或缺失部分DNA序列,2.1多态位点比率
导致位点间距离发生变化,表现为扩增产物分子量在RAPD标记检测到的61个位点中多态位点的差异。本研究采用POPGENEVERSION32软为46个,红松群体内多态位点比率为0.6935(表件¨引,对实验结果进行统计分析,计算了各居群多2),居群间多态位点比率为凉水地区>丰林地区。
表2红松居群内多态位点比率
Table2PercentageofpolymorphiclociwithinpopulationsP.Koraiensis
表3用Nei指数估算的红松龄居群内、居群间遗传多样?眭及遗传分化
Table3GeneticdifferentiationandgenediversitywithinandamonggroupsofPkoraiensisestimatedbyNei’Sindex
2.2用Nei指数计算的红松遗传多样性酶23个位点的研究,祖元刚等¨叫分析了3个红松
由Nei指数估算的凉水居群红松遗传多样性群体的lo种等位酶18个位点的多样性。对已报为0.2634、丰林居群红松的遗传多样性为道的天然红松群体的等位酶研究结果的统计表明,0.2607。红松居群内、居群间的遗传多样性及遗红松群体的平均多态位点比率为70.24%,居群间传分化见表3。的遗传分化低于6%。红松在等位酶水平上检测到
由上述结果可以看出红松的遗传多样性凉水的遗传多样性在松属植物中基本处于中等水平,在居群大于丰林居群。居群间遗传分化系数为植物界中则处于较高水平。17]。本研究在DNA水0.0849,说明红松遗传多样性主要存在于居群内,平上检测到的红松天然群体的遗传多样性与蛋白只有不足8.5%的遗传多样性存在于居群间。水平上的研究结果具有一致性,在居群间的遗传分3讨论化上,DNA水平上检测到的遗传分化高于等位酶。
针对松科植物的RAPD分析虽然已有报道,但由于
对红松群体的遗传多样性研究开始于上世纪资料尚不充分且已有的结果中物种间的差异较大,90年代,最早的报道主要集中在等位酶水平。杨还无法对松科植物在DNA水平上的多态状况做一一平等‘141对4个天然红松群体进行了3种酶4个归纳。例如:Mosseler等‘21对纽芬兰岛多脂松群体位点的分析,Kim‘15万 方数据3对8个红松群体进行了15种进行69个引物的RAPD分析,发现所有位点均为
2期吕建洲等:凉水、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的RAPD分析195单态;Szmidt等Ho对欧洲赤松的两个群体的RAPD认为下列因素是影响RAPD结果的主要因子:分析中,多态位点比率达到88.65%;汪小全等[91对(1)样本的数量。在遗传多样性的RAPD分银杉进行了RAPD分析,多态位点比率仅为32%;析中,不同的研究目的所使用的样本数量和检测位Khasa和Dancikul对白云杉和恩氏云杉的RAPD点数量是各有侧重的,对比夏铭与张恒庆研究结分析表明,多态位点分别占总位点的74%和70%。果,我们可以看出,虽然检测的位点数量两者相差对于红松群体的遗传多样性DNA水平上的研究,一倍多,但由于后者检测了更多的样本,检出的多主要集中于我国学者的RAPD分析。张恒庆等¨o-态位点比率仍然超出前者。因此,作者认为在进行曾对凉水国家自然保护区8个样地72个红松个体群体遗传多样性检测时,保证一定的样本数量是必进行了RAPD分析,多态位点比率为58.51%。夏要的。
铭等…1采用RAPD技术分析了中国东北3个天然(2)采样策略。除样本数量外,采样策略即样红松居群60个个体,多态位点比率为57.68%。品的代表性是影响RAPD分析结果的一个重要因
本研究红松群体内总的多态位点比率为素。本文作者2000年曾利用RAPD技术分析过凉69.35%,其中凉水居群为64.52%、丰林居群为水自然保护区五种林型下的红松遗传多样性,其采59.68%。从已发表的红松RAPD研究结果看(表样间距为20m;而本研究的样品间距在500In以4),本研究所获得的红松遗传多样性要高于以往上。因此,虽然本研究所用样品数量没有以前的研究的结果。对比不同研究的采样策略、所用的引多,但样品来自凉水保护区内更大的范围的个体,物检测位点数目、树木年龄,样地的生态条件,我们样品包含了更多的遗传变异。
表4红松RAPD研究结果
Table4StatisticsofP.koraiensisRAPD
与丰林自然保护区相比,凉水国家自然保护区可能会导致一些遗传多样性的丢失。
内保存着较多的遗传变异,这一结果与夏铭对凉Hamrick曾指出¨8I,具有高水平遗传变异的植水、虎林、黑河三个红松群体遗传多样性研究相一物种多为寿命长、地理分布广、风媒授粉和处于演致。凉水国家自然保护区保存着我国目前较大的替末期的物种,而红松基本具备了全部这些特征。原始红松林,该地区也是红松的现代分布中心¨…,但从红松的演化史来看,我国的红松分布区是第四该保护区的保护对象是以红松为主的温带针阔叶纪冰川结束后,从南部的避难中心朝鲜半岛向北迂混交林生态系统。区内森林类型多样,生境范围较回形成的[3,10l。由于红松地理分布的特点和亚洲宽,群体数量大,人为干扰很少,原始林中群落结构东北部受冰川侵袭路线的影响,冰期红松种群的数复杂,物种丰富,气候、土壤、局部生境都很适合红量会大大减少,使其种内的遗传多样性遭到损失,松生长,有利于遗传变异的积累。丰林自然保护区形成“瓶颈效应”,从而使红松的遗传多样性低于的地势较为平坦,目前保留的红松林近乎纯林,该应有的水平,同样的结果也发生于纽芬兰岛多脂松保护区是以红松母树林为保护目标的,成熟林和过群体’3o。熟林比例较大,在管理中的一些卫生问伐等过程,近一个世纪以来,由于受到人类的经济活动的
万 方数据
196植物研究
25卷
影响,红松的总面积急剧减少,斑块数量增多,针阔混交林的景观多样性和均匀性降低,使得红松的个niaclosed.cone
pine(Pinusradiata.P.miuricataandP.
attanuata).Genetics,1993,135:1187—1196
9.汪小全,邹喻苹,张大明.银杉遗传多样性的RADP分
体数量和遗传多样性均受到损失。又由于红松是长寿命物种,其遗传变异的积累需要相当长的时
间。因此,红松遗传多样性一旦丢失很难恢复,对
现存红松针阔混交林的保护应该得到足够的重视。
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