分散固相萃取_在线凝胶渗透色谱__省略_香港中成药中20种有机氯农药残留_谢耀轩

第31卷第7期2014年7月沈阳药科大学学报JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity

Vol.31No.7

Jul．2014p.535

2858（2014）07-0535-07文章编号：1006-

分散固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱

法检测香港中成药中20种有机氯农药残留

1，221，2

谢耀轩，王淑红，王铁杰，李

清

1*

（1．沈阳药科大学药学院，辽宁沈阳110016；2．深圳市药品检验所，广东深圳518057）GC-MS）测定香摘要：目的建立采用分散固相萃取和在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱法（GPC-港中成药中20种有机氯农药残留的分析方法。方法样品经乙腈涡旋提取，加入N-丙基乙二胺

N进行分散固相萃取净化后，（primary-secondaryamine，PSA）、C18-经在线凝胶渗透色谱（gelperme-ationchromatography，GPC）净化，采用气相色谱与质谱串联技术在离子检测方式下测定，以保留时

间和特征离子进行目标成分的定性鉴别，以外标法定量。结果20种有机氯农药在质量浓度2～100μg·L－1内均呈良好的线性关系，相关系数为0.9991～0.9999；3个水平加标回收率为83.8%～112.9%，ＲSD（n=3）为1.4%～8.1%；检出限为0.04×10－9%～0.76×10－9%，定量限为0.13

－9－9

×10%～2.52×10%，准确度和精密度进样精密度为1.2%～3.0%。结论本方法的灵敏度、均符合农药多残留检测技术要求，适用于香港中成药中20种有机氯农药残留的检测。关键词：分散固相萃取；在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱法；香港中成药；有机氯农药残留

中图分类号：Ｒ917文献标志码：A

随着野生药材资源的减少，人工种植的药材

而种植户为了替代野生药材入药已是大势所趋，

保证药材的产量和质量，不合理施用农药、甚至使

用高毒、高残留农药的现象日益突出。有机氯农药是我国现用农药种类中的一大类，属高毒、高残留品种，其化学性质稳定、难以生物降解、脂溶性强、易于在生物体富集，其长期累积污染可达20～

［1］30年之久，严重危及环境和人体健康。故各国

extraction

column，SPE）［5－6］、QuEChEＲS法

（quick，easy，cheap，effective，rugged，andsafe）［7－8］、凝胶渗透色谱（gelpermeationchroma-tography，GPC）［9］、固相萃取－凝胶渗透色谱（SPE-GPC）［10－11］等进行净化处理，这已是多组分农药残留分析的趋势。QuEChEＲS法在去除色素及中弱极性干扰物的能力不甚理想

［8］

，使用SPE

对有机氯农药在食品中的残留控制甚严，我国从20世纪60年代开始禁止在蔬菜、茶叶、烟草等作物施用滴滴涕（DDT）、六六六

［2］

存在工作效率和离线GPC进行多批样品净化时，

较低，时间长，溶剂消耗量大，操作繁琐等局限性

［12］

。为了实现方法简单化，样品处理自动化，

。《中华人民共

2005年版和2010版一部附录Ⅸ中均和国药典》

收载了9种有机氯农药的气相色谱检测方法，但仅对黄芪、甘草2种中药材检查项下规定了有机氯类农药残留限量要求

［3］80，283，附录Ⅸ

实现多组分农药残留的同时分析，最大程度地提

高农药残留的分析的速度，使用QuEChEＲS法-在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱法（gaschroma-tographymassspectrometry，GPC-GC-MS）［13－14］，已成为众多方法的首选。该法通过采用小型GPC

MS大体积进样法，柱，结合新开发的GC-能较大地提高方法的灵敏度；在线GPC不仅改善了离线

GPC净化耗时、消耗溶剂量大的局限性，而且能很好地弥补了QuEnChEＲS方法净化效果的不足，同时降低了基体背景，改善了峰形，提高分析结果的准确性和相关质谱图匹配性。本文作者针

，并未涉及到

其他常用中药材或中成药中有机氯农药残留的检

验，而香港中成药注册安全性资料技术指引已把本试验涉及的9类20种有机氯农药作为中成药安全性的必检项目

［4］

。目前，对于多组分农药残

留的分析，样品的前处理方法多采用超声处理、振

采用固相萃取柱（solidphase荡或均质提取后，

11-13收稿日期：2013-E-mailxyxtcm@http://wendang.chazidian.com；），男（汉族），广东清远人，主管中药师，硕士研究生，作者简介：谢耀轩（1982-*通讯作者：李清（1976-），女（汉族），辽宁沈阳人，教授，博士，博士生导师，主要从事中药质量控制、中药药代动力

Tel．024-23984392，E-maillq_yxm@http://wendang.chazidian.com。学研究，

536沈阳药科大学学报第31卷

对香港中成药注册对20种有机氯农药的检验要求，采用改进的QuEChEＲS方法对中成药样品进行前处理，即在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱法测定有机氯农药残留。

七氯、狄试剂、异狄氏剂、五氯硝基苯、甲基五氯苯

BHC、硫醚、氧化氯丹、顺式氯丹、反式氯丹、α-γ-BHC、BHC、BHC、pp'-DDE、pp'-DDD、op'-DDT、β-δ-pp'-DDT适量置于50mL量瓶中，用丙酮定容至L－1的混合标刻度，配制成质量浓度均为2.0mg·4℃保存。准储备液，

2.2GPC-GC-MS分析条件2.2.1

GPC条件

200凝胶渗透色色谱柱：ShodexCLNpakEV-谱柱（2.00mm×150mm），柱温：40℃，流动相：

丙酮-环己烷（体积比为3∶7），流速：GPC的淋出液收0.1mL·min－1，进样量：10μL，

集时间：4.09～5.49min。2.2.2

GC-MS条件

GC条件载气：高纯氦气，柱流速：1.75mL·min－1，程序升温进样口（programtem-peraturevolumeinjector，PTV）温度程序：120℃（5min）～（100℃min－1）～250℃（33.7min），色谱柱：惰性前置柱（无固定相）：5m×0.53mm，预

5MS（5m×0.25mm×0.25μm），柱：Ｒtx-分析柱：

Ｒtx－5MS（25m×0.25mm×0.25μm），柱温程序：82℃（5min）～（8℃min－1）～300℃（7.75min。MS条件：电子轰击离子（EI）源，离子源温度为200℃，接口温度为300℃，溶剂延迟时间：15min，检测电压：0.95kV，质谱检测模式：SIM。DDD和pp'-在SIM模式下20个组分中，除pp'-DDT外，其他18个成分均可达到基线分离，峰形GC-MS测定混合标准溶液（质良好。使用GPC-·L－1，进样体积20μL）的总离子流量浓度200μg图见图1，各成分保留时间及定性定量离子见表1。2.3

样品前处理方法

取供试品粉末约2g（颗粒剂、丸剂预先研细），精密称定，置50mL离心管中，精密加入乙

－1腈10mL，以3000r·min涡旋1min，加入无水

－1

MgSO41.0g，再以3000r·min涡旋1min，以

1仪器与试药

GPC-GCMSQP2010Plus在线凝胶渗透色谱-气相色谱质谱联用仪（日本Shimadzu公司），XS205电子天平（瑞士MettlerToledo公司），MS3

Digital涡旋混合仪（德国IKA公司），Z323高速离EBA21小型离心机（德心机（德国Hermle公司），

Milli-QAcademic纯水器（法国国Hettich公司），

Millipore公司）。乙腈（色谱纯，德国Merck公

司），丙酮（农残纯，美国Honeywell公司），环己烷（农残纯，美国Honeywell公司），无水MgSO4（优

600℃灼烧4h，贮于质纯，美国AlfaAesar公司，N-sec-密闭干燥器中备用），丙基乙二胺（primary-ondaryamine，PSA）（40～60μm，北京艾杰尔科技C18-N（40～60μm，有限公司），北京艾杰尔科技

有限公司）。

BHC、农药标准品：六六六［α-BHC、γ-β-BHC、δ-BHC、（benzenehexachloride）］、六氯苯

（hexachlorbenzene）、五氯硝基苯（quintozene）、五氯苯胺（pentachloroaniline）、七氯（heptachlor）、甲基五氯苯硫醚（pentachlorothioanisole）、艾氏剂（aldrin）、chlordane）、氧化氯丹（oxy-环氧七氯（heptachlor-epoxide）、chlordane）、反式氯丹（trans-chlordane）、顺式氯丹（alpha-狄试剂（dieldrin）、异

DDE（dichloro-di-狄氏剂（endrin）、滴滴伊［pp'-phenyl-dichloroethene）］、op'-DD，pp'-DDT滴滴涕［（dichloro-diphenyl-trichloroethane）］、滴滴滴［pp'-DDD（dichloro-diphenyl-dichlorothane），均购自农业部环境保护科研监测所，质量浓度为100mg·L－1，其中顺式氯丹和反式氯丹的质量浓度为20mg·L－1。

样品：消石灵胶囊、痔必清颗粒冲剂、静脑素胶囊、泻痢止胶囊、肿即消胶囊、脂康清胶囊、炎立消胶囊、育儿胶囊、平糖易胶囊、胃乐健胶囊、安宫降压丸、喉必清胶囊均为香港企业生产并申请在香港注册的中成药品种。

3500r·min－1离心5min；精密量取上清液2mL

50mgC18-N和300mg无置于含有100mgPSA，

－1

再以3000r·min水MgSO4的5mL离心管中，

2

2.1

方法与结果

标准溶液配制

分别取六氯苯、七氯、五氯苯胺、艾试剂、环氧

·min－1离心2min，以5000r取上清液涡旋1min，

过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。2.4线性关系考察

将质量浓度为100.0μg·L的农药混合标样逐级稀释为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、

－1

气相色谱-质谱法检测香港中成药中20种有机氯农药残留537第7期谢耀轩等：分散固相萃取－在线凝胶渗透色谱-

100.0μg·L－1的系列质量浓度，按“2.2.2”条进

－1

MS分析，行GC-以质量浓度（μg·L）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明在

r＞0.999，一定范围内，标准曲线线性关系良好，

结果见表3

。

1—α-BHC；2—Hexachlorbenzene；3—β-BHC；4—Quintozene；5—γ-BHC；6—δ-BHC；7—Pentachloroaniline；8—Hepta-chlor；9—Pentachlorothioanisole；10—Aldrin；11—Oxy-chlordane；12—Heptachlor-epoxide；13—Trans-chlordane；14—Al-pha-chlordane；15—pp'-DDE；16—Dieldrin；17—Endrin；18—op'-DDT；19—pp'-DDD；20—pp'-DDT

Fig1

Totalioncurrentchromatogramsofmixturesolutionof20pesticidesstandardsbyGPC-GCMS

图1

Table1

表1

No．1234567891011121314151617181920

BHCα-HexachlorbenzeneBHCβ-QuintozeneBHCγ-BHCδ-PentachloroanilineHeptachlor

PentachlorothioanisoleAldrinOxy-ChlordaneHeptachlor-epoxideTrans-ChlordaneAlpha-Chlordanepp'-DDEDieldrinEndrinop'-DDTpp'-DDDpp'-DDT

Pesticide

20种农药混合标准品的总离子流图20种农药的保留时间和选择离子t/min17.9218.0218.6418.7418.8619.6420.0720.8421.4021.7822.7922.9023.3923.7324.2924.3924.9225.3325.3626.28

Quantitation

ion219286219237181219265272296263387353373373318263263235235235

Quanticationion1181284181295219181267237263293185355375375246277281237237237

Identification

ion2183282183249183183263337246220237351377377248345345165165165

26327227231679317199199199Identification

ion3109249109214109109192100193193

Ｒetentiontimeandselectedionsof20pesticides

538沈阳药科大学学报第31卷

2.5精密度

－1

取质量浓度为10μg·L的20种有机氯混合标准溶液，按“2.2.2”条连续进样6次，测定各农药的峰面积，结果ＲSD均小于5%（n=6），表明仪器精密度良好，见表3。2.6方法检出限及方法定量限

根据质量浓度为2μg·L的混合对照品溶液各色谱峰的信噪比（S/N），以信噪比3倍和信

Table2

plingpredisionof20pesticides

表2

No．1234567891011121314151617181920

BHCα-HexachlorbenzeneBHCβ-QuintozeneBHCγ-BHCδ-PentachloroanilineHeptachlor

PentachlorothioanisoleAldrinOxy-ChlordaneHeptachlor-epoxideTrans-ChlordaneAlpha-Chlordanepp'-DDEDieldrinEndrinop'-DDTpp'-DDDpp'-DDT

－1

噪比10倍作为指标，并根据相应的样品取样量

和稀释倍数计算20种农药的方法检测限（limitsofdetection，LOD）和方法定量限（limitsofquanti-fication，LOQ），结果表明在上述样品预处理方法和色谱条件下，各农药的方法检测限（LOD）为0.04×10－9%～0.76×10－9%，方法定量限（LOQ）为0.13×10－9%～2.52×10－9%，结果见表2。

Linearequation，linearityrange，correlationcoefficient，limitsofdetection，limitsofquantificationandsam-20种农药的线性方程、线性范围、相关系数、方法检出限、方法定量限及进样精密度

Linearequation

A=1.904×103ρ+7.422×103A=1.355×103ρ+890.9A=3.273×103ρ－979.6A=416.4ρ+240.8A=3.622×103ρ+1.919×103A=1.424×103ρ－532.9A=3.173×103ρ－526.3A=1.847×103ρ+690.4A=946.1ρ+341.0A=2.558×103ρ+866.1A=616.2ρ+112.9A=292.3ρ+105.5A=2.659×103ρ+605.9A=2.060×103ρ+825.1A=4.012×103ρ+69.44A=1.014×103ρ－252.0A=1.122×103ρ+822.6A=7.516×103ρ－7.418×103A=6.727×103ρ－2.084×103A=6.838×103ρ－6.908×103

ρlinearityrange/（μg·L－1）2～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～1002～100

r0.99940.99930.99970.99940.99960.99970.99980.99950.99970.99980.99980.99960.99940.99930.99970.99970.99960.99990.99990.9999

wLOD/%（×10－9）0.170.110.240.760.180.290.120.250.220.120.260.560.050.070.050.600.410.060.050.04

wLOQ/%（×10－9）0.570.350.792.520.590.970.390.850.740.390.871.880.160.220.182.011.370.190.170.13

ＲSD/%2.12.72.02.82.43.01.72.92.12.22.82.22.12.71.22.22.52.21.22.5

Pesticide

2.7回收率试验2.8

取炎立消胶囊内容物约2g，精密称定，共

9份，分别精密加入混合对照品储备液（质量浓度0.25、0.5mL，·L－1）0.05、挥干溶剂，为2mg进行

－1－1

低（10μg·L）、中（50μg·L）、高（100μg·L－1）3个水平的添加回收试验，每个水平加样平行3份，按上述的样品前处理方法和GPC-GC-MS分析条件进行检测，计算20种农药回收率。结果3个添加水平下所有农药的回收率ＲSD（n=3）在1.4%～均在83.8%～112.9%，

8.1%，结果见表3。

样品的测定

取收集到的12种香港中成药（主要为胶囊

“2.3”“2.2”按照和条进行检剂、颗粒剂和丸剂），测，每份样品平行测定3次，结果平糖易胶囊样品

中检出甲基五氯苯硫醚（pentachlorothioanisole）和

五氯苯胺（pentachloroaniline），含量质量分数分别

－8－8

为8.75×10%和1.22×10%；脂康清胶囊样含量为品中检出五氯苯胺（pentachloroaniline），

3.0×10－8%。虽然平糖易胶囊检出甲基五氯苯硫醚和五氯苯胺，脂康清胶囊检出五氯苯胺，但残留量也符合香港中成药注册中对有机氯类农药残

气相色谱-质谱法检测香港中成药中20种有机氯农药残留539第7期谢耀轩等：分散固相萃取－在线凝胶渗透色谱-

留量的限量要求（五氯硝基苯的最高残留量以五

氯硝基苯、五氯苯胺和甲基五氯苯硫醚三者之和

Table3

表3

No．1234567891011121314151617181920

BHCα-HexachlorbenzeneBHCβ-QuintozeneBHCγ-BHCδ-PentachloroanilineHeptachlor

PentachlorothioanisoleAldrinOxy-ChlordaneHeptachlor-epoxideTrans-ChlordaneAlpha-Chlordanepp'-DDEDieldrinEndrinop'-DDTpp'-DDDpp'-DDT

Pesticide

－6

计，不得高于1．0×10%）。

Determinationrecoveriesandprecisionof20pesticides

20种农药的回收率测定结果（n=3）

·L－1ρmiddle=50μgＲecovery/%

93.888.292.398.492.298.695.394.4101.790.591.294.690.892.897.593.595.997.895.799.9

ＲSD/%2.74.18.11.82.85.91.43.34.62.82.24.72.12.42.02.02.12.73.43.9

·L－1ρhigh=100μgＲecovery/%106.497.098.0110.4104.0112.9110.9104.5111.2105.0103.3107.8108.4107.6111.2107.9108.3112.6108.5110.0

ＲSD/%2.12.22.42.32.33.02.42.62.22.32.14.52.62.64.23.84.04.02.64.6

·L－1ρlow=10μg

Ｒecovery/%

95.383.8105.889.795.6105.779.398.992.391.095.996.9100.398.698.091.4100.398.298.4106.9

ＲSD/%4.95.72.88.13.51.95.23.88.03.75.82.83.22.95.14.82.53.13.51.8

3

3.1

讨论

香港中成药注册安全性资料中农药残留技

进行定性，易受基质干扰，且易产生假阳性结果，需用不同极性的气相色谱柱作进一步分析或用气相色谱质谱法进行核实，操作性一般。因此，目前主流的方法都优先选用气相色谱质谱联用法进行农药残留的测定。3.2

本实验中所用的改进的QuEChEＲS法

QuEChEＲS法是美国分析化学协会AOAC2007.01与欧盟标准EN15662均采用的农

［7－8］

术指引的局限性

香港中成药注册安全性资料技术指引推荐使

用磺化法、柱层析法、凝胶渗透层析法等作为净化ECD检测中成药中有机氯农药方法，并采用GC-的残留量。由于中成药的处方量较大，含有的中药材样品药用部位多样，且每一种药材都有其特殊性，基质成分复杂，化学干扰成分众多，待测农药成分又多在痕量水平，导致提取、净化难度大。同时，单一的处理方法往往效果一般，如采用多步净化不仅增加了工作量和降低工作效率，而且会损失目标成分。如对酸不稳定的五氯苯胺、狄氏剂、异狄氏剂就不能使用磺化法进行处理。另外，

ECD检测多组分农药残留，用GC-根据以往的实验结果分析，净化后的样品上机测定，所有目标成分与干扰物未能全部达到基线分离，以保留时间

残测定前处理方法，提出以单一溶剂提取多

N和石墨化碳C18-种农药，并采用直接加入PSA、

GCB）等固相吸附剂黑（graphitizedcarbonblack，

的方法进行净化，以去除脂肪酸、有机酸和色素。

由于中成药的含水量不高，所需测定20种有机氯农药均非酸性成分，而乙腈的通用性强，对农药的提取效率高，因此采用乙腈作为提取溶剂。在样N，PSA与C18-品提取液净化时加入无水硫酸镁、

其中无水硫酸镁用于去除有机层中的少量水分，从而保证PSA与其他吸附剂粉末的性能不受影