Western Blot 实验方法&注意细节2015

WB方法&重要步骤注意的细节,实验室内部资料

Western Blot 实验方法参考

以下是根据个人实验总结的方法，所以可能有些步骤和他人具体实验有出入，仅供交流参考。红色标注是重点注意的，易影响后期操作结果的。写了能想到的细节，故看起来较琐碎，不连贯。

1. 蛋白质变性

按比例蛋白中加入载样缓冲液，混匀瞬离。PCR仪 95℃ 7--8min ，每孔最大上样量25ul，但超过20ul跑出来的就不好看了，十几ul比较合适；预染marker 2.5ul就可以较好显出，建议文章并图加大用量。（以上是我个人实验的用量，之后不在说明。）

蛋白加样等操作做建议严格冰上执行。

2. 配胶

建议早上一来先开始配胶，胶干过程中再其他操作。

10%分离胶（5ml）

H2O 1.9ml

3%AB 1.7m

1.5M Tris-HCL(pH8.8) 1.3ml

10%SDS 50ul

10%AP 50ul

TEMED 5ul

4%浓缩胶（3ml）

H2O 2.1ml

3%AB 0.5ml

1M Tris-HCL(pH6.8) 0.38ml

10%SDS 30ul

10%AP 50ul

TEMED 5ul

2.1 安装玻璃板

取出干净、无水的玻璃板，一次性垂直固定在架子上，卡好后切勿用手再去拨动按压，如此易漏胶。架子水平放置，后期压线平直，具体可专门安置出一块水平地方，单独留于做WB配胶。

2.2分离胶配置

制分离胶时按照配方顺序加样，每加一种摇动混匀，避免后期胶的成分不均匀影响跑样。尤其是AP，TEMED加入后，TEMED主要用于凝胶，其用量决定胶凝固的时间长短，操作时快速。

灌胶时可用大枪，固定在玻璃板一侧加，不移动加样。全部加完胶后摇一摇架子，使胶分布均匀，线水平。

之后加水压线，加水时枪尽量放水平，缓速边移动边加，如此是为了水均匀压到胶面上，避免同一个地方加水而使胶面难以恢复水平。

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凝胶时间具体配方、温度不同，我后期用以上配方，40min室温凝胶（5-6月）效果很好，禽方向当时时间也差不多如此。个人试过的最长室温凝胶时间2h，效果和后期用的这种目测无差别。放入烘箱凝胶也是一种加快速度方法，不过要注意压线的水不要蒸干了，也要注意胶凝早期，途中不要在拿出继续室温凝胶，否则易出现两条线。后期剥胶可能后有粘黏，时间配方待改进。

2.3浓缩胶配置

浓缩胶在剩AP和TEMED未加时，建议此时倒掉玻璃板中压线的水，成股流下的水用吸水纸吸干。过早倒掉水，会使分离胶表面变干，目测会观察到水平线两侧出现弧度。灌胶方法同分离胶，灌满之后再缓慢插入梳子，操作中避免气泡 浓缩胶凝固时间强烈建议适度延长时间，否则后期洗孔时会有胶在孔内，梳子也要选择匹配的，不然无法紧密贴合两侧玻板，使得孔内有一层胶，后期洗孔、加样相当麻烦。 我试过凝胶过夜，早上一来立马跑胶，各种配方胶凝的都非常好，孔内很干净，但是跑样的效果与现配胶比略次。

浓缩胶现在用的梳子都是一旦插入无法凝胶时补胶，故此孔建议点marker，量少so无影响。

3. 装置电泳槽

小玻璃板向内，大玻板向外。只跑一板，则对侧用塑料板代替，有字面朝外。装置过程中一定玻璃板使劲下压，同时再扣紧开关固定好玻板，避免后期漏液过快。

倒电泳液至内槽满，外槽加电泳液的量尽量少，刚好够可以电泳为止即可（外槽电泳液太少会出现接通电源却没跑，所以等确定电泳上了再离开）。电泳液尽量新鲜不重复利用，虽不要求现配现用（如此最好），每次只配1L，保存4℃，3-4天更换即可，电泳液直接影响跑胶的效果！新鲜的和超过4天的差异极显著。存放时间太长会变粘稠，跑胶跑不动！

4.洗孔

轻拔梳子，用注射器洗孔，此步骤不能少。

5.上样

6. 电泳

浓缩胶80V，分界线处压成线停止，转分离胶100V。具体时间根据自己实验总结，电泳的时间长短与电泳液的质量也有密切关系。

电泳中途经常查看，及时补加内槽电泳液，保持较高液面差，有利电泳。

7. SDS-PAGE

建议做WB之前先只做到SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺不联系凝胶电泳）为止，检测蛋白熟悉电泳操作。

剥离的胶用考马斯亮蓝250染色过夜，再用纯水加冰醋酸加甲醇至水平摇床上漂洗，加热会更快。

8.转膜（此处只介绍半干转，理论上适用于小分子蛋白，理论建议120KD以上用湿转。个

人实验中的蛋白基本不超过130KD，半干转效果极显著优于湿转）

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8.1．PVDF膜和滤纸的处理

根据转膜面积剪裁好PVDF膜（实验室现用的膜不分正反面），浸泡在甲醇中1-2min激活，后放置在转膜液中备用。滤纸在转膜液中浸泡至饱和备用，面积做到：滤纸≥PVDF膜≈胶。滤纸可以酌情回收利用，在不污染膜上蛋白的情况下。

8.2 胶的处理

把玻璃板超纯水冲洗干净，剥去浓缩胶。把需要转膜的胶切割下来，短时间内浸泡在转

膜液中平衡，备用。割胶时一次性切下去，避免胶边连带细条胶，后期转膜放胶时操作不方便。

8.3 制备转膜层

总的来说，两片滤纸分别位于最外层，包裹住PVDF膜和胶。膜位于阳极，凝胶位于

阴极，蛋白分子带负电荷，故向膜的方向移动。转膜层中贴合紧密无气泡。

以实验室的半干转仪器为例：先放一片滤纸，把浸泡在转膜液中的PVDF膜捞出，从

一侧缓缓拖至滤纸上，最终贴合紧密无气泡。建议排除气泡时不要用剥胶片去刮，膜干了之后会发现上面全是刮痕。用剥胶板托着凝胶，放置PVDF膜上，使其完全覆盖，避免气泡，操作小心谨慎。之后轻轻覆盖上另一片滤纸，用剥胶板刮出气泡，操作过程中避免已放好的那些出现挪动。最后盖上红色的盖子。

8.4 转膜

正确连接电源线。根据转膜的面积和蛋白质分子量大小摸索出合适的电压及时间。（网

上有些是按照电流来转）。实验室现用的国产转膜仪器最大电压30V，切勿超过。 我的实验电压可供参考 21KD,36KD剪裁成条带状同时转，24V，30min。

56KD,74KD剪裁成条带状同时转，24V, 1h 或 27V，35min 我后期是这四种蛋白24V同时转，30min取出两个小的，剩下的接着转，注意操作过程

中避免继续转的胶膜位移。

9. 膜染色、胶染色

预实验阶段建议在接着上抗体前多检测几次蛋白转膜情况，得出最适转膜电压和时间。

9.1膜丽春红染色

膜浸泡在丽春红溶液中，浓度大小不同染色时间不同，一般几分钟后就可以查看有无条

带。洗膜用超纯水漂洗几次即可看到。丽春红是可逆性染色。

9.2膜考马斯亮蓝250染色

一般不建议用，因为是非可逆性染色。但考马斯亮蓝的灵敏度高于丽春红，若丽春红几

乎看不清条带的话，不死心可以一试。漂洗时间会很长，背景色很难洗浅。

9.3胶考马斯亮蓝250染色

建议转膜后胶别丢，染色查看。1）看是否有的蛋白。若膜无蛋白，胶有蛋白，说明转膜

没转上。2）看是否有目的分子量蛋白。若膜上有目的蛋白，但胶上也有，说明转膜不完全，要延长转膜时间。一般来说膜上有目的蛋白，胶上只剩大分子量蛋白就可以不用管了。

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以下的所有孵育、漂洗工作都要保证膜做好标记，膜向上放置，操作中避免蛋白面过多接触器皿壁。在实验操作摸索阶段，记录好每次的时间，温度，液体用量，便于最后固定。因为膜的大小个数有差异，以下省略个人的液体用量。

10.封闭

碧云天封闭液，完全覆盖膜。37℃，3h，

11.一抗孵育

一抗（北京博奥森BIOSS）稀释比 1:1000 ，4℃孵育过夜，14h-16h左右。

一抗稀释液（碧云天），一抗可重复利用3-4次。

阴性改为匹配的血清同等条件下孵育。

理论一抗选择是否可用于实验动物，是看抗体说明书的交叉反应物种中有无实验动物。

12.一抗漂洗

TBST 10min*3次

13.二抗孵育

二抗（北京博奥森BIOSS） 稀释比 1:400 ，37℃，2h

二抗稀释液（碧云天），二抗可重复利用3-4次。

14.二抗漂洗

TBST 10min*3次

TBS 5min*2次

15.ECL显色

ECL超敏化学发光检测试剂盒（碧云天），按说明书配置，现配现用，避光保存。

检测时再滴加显色液前，调整好膜的位置和成像仪的滤镜，调整好曝光时间和照相时间次数。

显色液覆盖膜，即可照相，一般立马就有条带。有时可能开始刚加显色液条带显色不明显，再照一次可加深。

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附:

电泳缓冲液（1X） Tris-Base 3.03g 甘氨酸 18.99g SDS 1g --------------------------- +d H2O 1L

转膜液（1X）

甘氨酸 2.9g Tris-Base 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml

--------------------------------- + d H2O 800ml

TBS

Tris-HCL 1.57g Nacl 8.8g

------------------------------------ +d H2O 1L pH 7.5-8.0

TBST

1LTBS+600-700ul吐温

fz实验室 2015年