高迁移率族蛋白B1真核表达载体的构建及其对肿瘤坏死因子α报告基因活性的影响

生垦主亘匿鱼金鱼塾盘查；！！！生！旦箜！！鲞筮！塑壁！ｉ璺』！里坚旦丛曼！韭堡！坚：丛！ｚ！！！！！∑！！：！！：塑竺：！

１７１

论著

高迁移率族蛋白Ｂ１真核表达载体的构建及其对

肿瘤坏死因子一仪报告基因活性的影响

杨丽萍１，姚咏明１，李杰萍２，叶棋浓２，盛志勇１

（１．解放军总医院第一附属医院烧伤研究所，北京

１０００３７；

２．军事医学科学院生物工程研究所，北京１００８５０）

【摘要】目的克隆人的高迁移率族蛋白Ｂ１（ＨＭＧＢｌ）基因，插入ｐｃ—ＤＮＡ３载体中并检测其对肿瘤坏死

因子一ａ（ＴＮＦ—ａ）报告基因活性的影响。方法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，从人乳腺癌细胞系ＭＣＦ一７基因

组中扩增出ＨＭＧＢｌ基因，插入载体ｐｃ—ＤＮＡ３中，确定所扩增的ＤＮＡ序列；用蛋白质免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）在２９３Ｔ细胞中检测其表达；应用报告基因方法检测其对ＴＮＦ—ａ报告基因表达的影响。结果酶切和测序结果表明扩增的ＨＭＧＢｌ序列正确，大小为６４８ｂｐ。在２９３Ｔ细胞中正确表达相对分子质量约２４０００的ＨＭＧＢｌ蛋白。下游基因ＴＮＦ—ｑ荧光素酶活性实验显示，构建的真核表达载体在内毒素刺激后以先增加后降低的方式影响ＴＮＦ—ａ的活性，且对从９５—１２０长度的ＴＮＦ—ａ报告基因活性影响最明显。结论ＨＭＧＢｌ以先增加后降低的方式影响ＴＮＦ—ａ基因的表达，且主要通过２６个碱基大小的片段发挥作用。

【关键词】高迁移率族蛋白Ｂ１｝表达，报告基因活性｝肿瘤坏死因子一ａ

中图分类号：Ｑ７８６；Ｑ８１３．１１

文献标识码：Ａ文章编号：１００８—９６９１（２００８）０３一０１７１一０４

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ一１ｐｒｏｔｅｉｎｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆａｃｔｏｒ—ａ

ｒｅｐｏｒｔｅｒ

ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔ

ｏｎ

ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ

ｇｅｎｅａｃｔｉｖｉｔｙ

ＹＡＮＧＬｉ—ｐｉｎ９１，ＹＡＯＹｏｎｇ－ｍｉｎ９１，￡，Ｊｉｅ—ｐｉｎ９２，ＹＥＱｉ－ｎｏｎ９２，ＳＨＥＮＧ

Ｚｈｉ—ｙｏｎ９１．１．ＢｕｒｎｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｉｒｓｔ１０００３７，Ｃｈｉｎａ；２

Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ

ＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄ

ｔｏＴｈｅＣｈｉｎｅｓｅ尸ＬＡＧｅｎｅｒａｌ

Ｈｏｓｐｉｔａｌ。Ｂｅｉｊｉｎｇ

ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５０，ＣｈｉｎａＹｏｎｇ－ｍｉｎｇ（Ｅｍａｉｌ：ｆ—ｆｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ）

Ｔｏ

ｃｌｏｎｅｈｕｍａｎｈｉｇｈ

ｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｇｒｏｕｐ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹＡＯ

［Ａｂｓｔｒａｃｔ】

ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ

Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ

ｏｎ

ｂｏｘ一１

ｇｅｎｅ

ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＭＧＢｌ）ｇｅｎｅａｎｄ

Ｔｈｅ

ｈｕｍａｎ

ｉｔｓｅｆｆｅｃｔｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ

ｆａｃｔｏｒ—ａ（ＴＮＦ—ａ）ｒｅｐｏｒｔｅｒ

ｃａｎｃｅｒ

ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ

ＨＭＧＢｌ

ｇｅｎｅ

ｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄ

ｃｌｏｎｅｄ

ｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔ

ｉｎｔｏ

ｃｅｌｌｌｉｎｅ

ＭＣＦ一７ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ

ｂｙ

ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．

ｇｅｎｅ

ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎｄ

ｐｃ－ＤＮＡ３．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｇ

ｐｌａｓｍｉｄｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ

ＨＭＧＢｌｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇｉｎ２９３Ｔｃｅｌｌｌｉｎｅ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ

ａｐｐｌｉｅｄ

ｔｏ

ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓ

ｏｆＤＮＡ

ａｎａｌｙｚｅ

ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＨＭＧＢｌ

ｏｎ

ＴＮＦ—ａ

ｇｅｎｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ

ｇｅｎｅ

Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ

ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｌｏｎｅｄｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ２９３Ｔｃｅｌｌ３００

ｔＯ

ＨＭＧＢｌｗａｓｃｏｒｒｅｃｔ（６４８

ｇｅｎｅ

ｂｐ）．ＨＭＧＢＩｐｒｏｔｅｉｎ

ａｔ

ｂｅ

ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２４０００．ＴＮＦ一口ｒｅｐｏｒｔｅｒ

ａｔ

ａ

ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ｐｅａｋｉｎｇ

ｔｘｇ／ＬＨＭＧＢｌ ａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｄｏｓｅｅｘｃｅｅｄｉｎｇ

ｃａｎ

５００／ｘｇ／ＬＨＭＧＢｌ．９５－１２０ｂｐＴＮＦ—ａ

ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ

ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＨＭＧＢｌ

ｍａｒｋｅｄｌｙｒｅｇｕｌａｔｅＴＮＦ－ａｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ

ａｎ

ｕｐ—ｔｏ—ｄｏｗｎ

ｍａｎｎｅｒ。ｗｈｉｃｈｍｉｇｈｔｂｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｆｒａｇｍｅｎｔ９５—１２０ｂｐｉｎＴＮＦ—ａｐｒｏｍｏｔｅｒ．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｎｅｃｒＯＳｉｓｆａｃｔｏｒ—ａ

ｇｒｏｕｐ

ｂｏｘ１ｐｒｏｔｅｉｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ

ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅａｃｔｉｖｉｔｙ；ｔｕｍｏｒ

业已明确，高迁移率族蛋白Ｂ１（ＨＭＧＢｌ）作为一种新的晚期炎症介质，具有显著的胞外致炎效应ｎ’。在脓毒症早期，肿瘤坏死因子一ａ（ＴＮＦ—ａ）等细胞因子可迅速合成，随着炎症的发展，ＨＭＧＢｌ则进一步促进其产生与释放，从而加剧脓毒症的发生发

基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（２００５ＣＢ５２２６０２），国家自然科学基金课题（３０６７２１７８）

通讯作者；姚咏明，教授，博士生导师，ＥｍａｉｌＨ—ｆｆ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ作者简介：杨丽萍（１９７２一），女（汉族），山西省人，博士研究生，讲师，主要从事烧伤感染与免疫研究工作。

展。’。本实验中通过观察ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ报告基因活性及ＴＮＦ—ａ不同片段活性的影响，旨在进一步明确ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ基因表达水平影响的分子机制。

１材料与方法

１．１

实验材料：ＳＶ４０病毒转化的人胚胎肾细胞

２９３Ｔ，用含体积分数为１０％的热灭活胎牛血清的Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培养基（ＤＭＥＭ）、于体积分数为５％的ＣＯｚ孵箱内３７℃下常规培养（由本实验室保存）。ｐｃ—ＤＮＡ３载体购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；大肠

１７２

生国生堕匡堡金鱼墼垄查！！！！生ｉ旦笙！！鲞箜！塑垦！！！』！堡丛旦坚曼！韭曼！竺！Ｍ！ｚ！！！！：！！！：！！！塑！：！

杆菌ＤＨ５ａ表达ｐ一半乳糖苷酶活性由本实验室保存。含人不同长度ＴＮＦ—ａ报告基因质粒由北京大学顾军教授馈赠。限制性内切酶、ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ酶购自日本ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ纯化试剂盒购自上海申能博彩公司ｆＤＭＥＭ培养基、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００转染试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；血细胞凝集素辣根过氧化物酶（ＨＡ—ＨＲＰ）抗体购自美国Ｓｉｇｍａ公司。

１．２人乳腺癌细胞系ＭＣＦ一７ＤＮＡ的提取：按照北京Ｔｉａｎｇｅｎ公司的说明书进行。将贴壁细胞处理为细胞悬液，加２００弘Ｉ缓冲液，振荡至悬浮；加２０

ｐ１

蛋白酶Ｋ，混匀；加２２０弘ｌ缓冲液，混匀；加２２０弘ｌ无水乙醇，混匀，过ＣＢ３柱，依次用去蛋白液、漂洗液洗柱，彻底晾干残余的漂洗液，最后洗脱即得

ＭＣＦ一７ＤＮＡ。测定波长２６０ｎｍ处的吸光度（Ａ）值。

１．３人ＨＭＧＢｌ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增：根据ＧｅｎＢａｎｋ中报告的序列设计引物。上游引物为：

５７一ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴ一３７；下游引

物为：５，＿ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ一３７。上下游引物５’和３　

７端分别携带ＥｅｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切位点。ＰＣＲ引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。ＰＣＲ模板为人乳腺癌细胞系ＭＣＦ一７

ＤＮＡ。

ＰＣＲ反应条件为：９４℃变性１ｍｉｎ，然后５２℃复性ｌ

ｍｉｎ，７２℃延伸５ｍｉｎ，共２５个循环。

１．４真核表达载体的构建、酶切鉴定与测序：将纯化后的上述ＰＣＲ产物经ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切后连接到经同样酶切的ｐｃ—ＤＮＡ３载体中，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，提取转化质粒。采用以上两种内切酶进行酶切鉴定，得到目的基因大小片段的克隆判定为阳性克隆，然后进行测序。

１．５重组质粒的真核表达鉴定：将测序正确的阳性克隆重新转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，提取质粒去除内毒素后转染２９３Ｔ细胞，采用蛋白质免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ），并使用特异性抗ＨＡ抗体检测其表达蛋白大小。１．６细胞转染

１．６．１细胞培养：２９３Ｔ细胞为本室保存，用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ于Ｃ０。培养箱（３７℃，５％ＣＯ。）中培养。转染前２４ｈ将细胞接种于灭菌的２４孔板，细胞密度大约为９０％。

１．６．２不同剂量重组质粒对全长ＴＮＦ—ａ报告基因荧光素酶活性的影响：将质粒用ＬｉｐｏｆｅｅｔＡＭＩＮＥ２０００瞬时转染２９３Ｔ细胞。将重组质粒ＤＮＡ分为

１００、２００、３００、５００、１０００和１

５００弘ｇ／Ｌ组，等量的空

载体ｐｃ—ＤＮＡ３用于对照。每次转染实验中，重组质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ按照分组的剂量、表达ｐ半乳糖苷酶的质粒０．１ｌｕｇ、全长ＴＮＦ—ａ报告基因质粒０．２弘ｇ与１００弘ｌ不含血清、抗生素及酚红的ＤＭＥＭ混合，再将２．５弘ｌＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００与１００ｐｌ相同的ＤＭＥＭ混合；将上述二者混合，室温放置２０ｍｉｎ后加入０．８ｍｌ含１０％胎牛血清的细胞培养基中。２４ｈ

后收集细胞，测定荧光素酶和』３一半乳糖苷酶活性，其

中ｐ半乳糖苷酶活性用于校正细胞转染效率。１．６．３一定剂量重组质粒对不同长度ＴＮＦ一盘报告基因荧光素酶活性的影响：每次实验中重组质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ为３００ｔｚｇ／Ｌ、表达ｐ半乳糖苷酶质粒为０．１，ｕｇ；ＴＮＦ—ａ报告基因质粒０．２弘ｇ，包括５个长度，分别是１—９５、１—１２０、１—１６１、１—６１５、１—１１３５。等量的ｐｃ—ＤＮＡ３空载体作为对照。转染４ｈ后加内毒素，刺激２４ｈ后收集细胞，方法同上。

１．７荧光素酶和ｐ半乳糖苷酶活性测定：荧光素酶活性测定按照Ｐｒｏｍｅｇａ公司说明书进行。细胞用磷酸盐缓冲液洗１次，在２４孔板中加入８０肛１裂解缓冲液，室温轻摇１５ｍｉｎ；收集细胞裂解物至离心管中，持续振荡５ｍｉｎ后离心，收集上清液，取１０弘ｌ用荧光计测定荧光素酶活性。用邻一硝基苯一口一Ｄ一半乳糖苷（０ＮＰＧ）测定ｐ半乳糖苷酶活性。取上清液１０弘ｌ与９０ｐｌ缓冲液／ｐ巯基乙醇溶液混合，加人

２０肛１４

ｔ－ｇ／Ｌ的ＯＮＰＧ，３０℃孵育，直到出现浅黄色

为止；然后加入５０弘ｌ

１

ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２Ｃ０３溶液终止

颜色反应，测定样品在波长４２０ｎｍ处的Ａ值。

２

结

果

２．１

人ＨＭＧＢｌ的ＰＣＲ扩增（图１）：从乳腺癌细

胞系ＭＣＦ一７基因组中扩增人ＨＭＧＢｌ长度６４８

ｂｐ。

１：ＨＭＧＢｌＩＭ：Ｍａｒｋｅｒ

图１人ＨＭＧＢｌ

ＰＣＲ扩增产物

中国中西医结合急救杂志２００８年５月第１５卷第３期

ＣｈｉｎＪＴＣＭＷＭ

Ｃｒｉｔ

Ｃａｒｅ，Ｍａｙ

２００８，Ｖ０１．１５，Ｎｏ．３

１７３

２．２

ｐｃＤＮＡ３一ＨＡ—ＨＭＧＢｌ真核表达载体的构建５００弘ｇ／Ｌ时，ＴＮＦ—ａ的活性开始下降。

（图２）：用ＥｃｏＲＩ和ＸｈａＩ双酶切ＰＣＲ产物后克

ｇ

隆到经同样双酶切的ｐｃ—ＤＮＡ３载体中，将得到的７

重组质粒命名为ｐｃＤＮＡ３一ＨＡ—ＨＭＧＢｌ。提取质粒６

后用上述相同内切酶进行酶切，然后ＤＮＡ电泳，切５

出大小为６４８ｂｐ的片段。ＤＮＡ序列结果证实，该插４

入片段为人ＨＭＧＢｌ基因。－

靼懈装糕

３

２

，

０

０

１００

２００

３００

５００

ｌ

０００

ｌ

５００

ＨＭＧＢ１浓度（ｐｇ／Ｌ）

图４不同剂量重组质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ对全长ＴＮＦ—ａ

报告基因荧光素酶活性的影响

２．５一定剂量重组质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ对不同长度ＴＮＦ—ａ报告基因荧光素酶活性的影响（图５）：在ＨＭＧＢｌ作用剂量为３００肛ｇ／Ｌ时，将ＨＭＧＢｌ与不同长度ＴＮＦ—ａ报告基因共同转染２９３Ｔ细胞。与不加内毒素比较，内毒素刺激后１—１２０长度报告基因Ｍ：Ｍａｒｋｅｒｆｌ、２依次为质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ双酶切产物、

活性升高幅度最大，为１２．８４倍；全长报告基因升高　

原质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ

幅度次之，为２．２５倍；而１＿９５长度报告基因变化不图２

ｐｃＤＮＡ３一ＨＡ—ＨＭＧＢｌ真核表达载体的酶切鉴定

明显，１—１６１和１—６１５长度报告基因则下降。

２．３重组质粒的真核表达（图３）：将１肛ｇ重组质粒１００００

转染２４孔板，转染步骤同前。用抗ＨＡ抗体检测到８０００

相对分子质量为２４０００的蛋白，与预期结果一致。

趔６０００

懈

兴杈４

０００

２０００

０

１－９５

ｌ－１２０

卜１６ｌｌ一６ｌ５

１ １１３５

不同长度ＴＮＦ—ａ报告基因

图５

３００

ｕｇ／ＬＨＭＧＢｌ对不同长度ＴＮＦ－ａ

报告基因荧光素酶活性的影响

３讨

论

近２０年来，ＴＮＦ—ａ和白细胞介素一１（ＩＬ一１）等早

１、２依次为阳性克隆１表达，阳性克隆２表达；Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ

图３

ＨＭＧＢｌ重组质粒的真核蛋白表达

期炎症细胞因子在脓毒症发病中的作用已受到广泛关注，尽管拮抗ＴＮＦ—ａ等细胞因子在动物实验中获２．４

不同剂量重组质粒ＨＡ—ＨＭＧＢｌ对全长

得成功，然而这些干预新措施在多项脓毒症临床试ＴＮＦ—ａ报告基因荧光素酶活性的影响（图４）：在验中均未取得明显疗效。近年来，ＨＭＧＢｌ作为脓毒２９３Ｔ细胞中，不加内毒素时，ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ的症晚期炎症介质的发现，重新开启了人们的研究思活性几乎没有影响．力Ⅱ人内毒素后，随着ＨＭＧＢｌ浓路。研究证实，在脓毒症的病理过程中，ＴＮＦ—ａ水平度的升高，ＴＮＦ—ａ的活性也逐渐升高，最高可达到呈现双峰改变，说明其表达在早期和晚期出现了两４．８倍（ＨＭＧＢｌ为３００ｐｇ／Ｌ）。但是当其浓度超过

次高峰。３。感染早期内毒素激活ｐ３８丝裂原活化蛋

１７４

生垦主亘匡笙金鱼墼盘查！！！！堡！旦笙！！鲞箜！塑曼竖呈！！里丛里坚堡！韭曼！望！丛！！！！！！！∑！！：！！！型！：！

白激酶（ＭＡＰＫ）通路后，ｐ３８ＭＡＰＫ发生磷酸化，ＴＮＦ—ａ基因表达水平增加；同时ＴＮＦ—ａ又可进一步引起ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化和促进晚期炎症介质ＨＭＧＢｌ的释放“。５３。还有研究观察到，ＨＭＧＢｌ在脓毒症晚期升高，一方面对动物具有致死毒性，另一方面分泌到细胞外与其他炎症介质ＴＮＦ—ａ、ＩＬ一１、７一干扰素等相互作用，促进炎症效应放大哺３。因此，ＨＭＧＢｌ作为新的重要炎症介质参与了脓毒症的发展，然而有关ＨＭＧＢｌ介导脓毒症发生的确切机制仍未完全阐明，如何引起ＴＮＦ—ａ释放的信号机制尚不清楚订３。我们既往的实验证明，通过抑制信号途径下调ＨＭＧＢｌ产生可显著降低ＴＮＦ—ａ基因表达水平。’。另有研究证实，ＨＭＧＢｌ和ＴＮＦ—ａ在体外存在相互诱生的关系；ＨＭＧＢｌ抑制剂丙酮酸乙酯可

先增加后降低的方式影响下游基因ＴＮＦ—ａ的表达，且主要通过２６个碱基大小的片段发挥作用。该实验初步阐明了ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ合成的调节机制，为深入探讨ＨＭＧＢｌ相关信号通路的分子基础及其干预途径提供了理论依据哺３。参考文献

［１］Ｍｉｔｏｌａ

１ａｒ

Ｓ，Ｂｅｌｌｅｒｉ

Ｍ，Ｕｒｂｉｎａｔｉ

ｇｒｏｕｐ

Ｃ，ｅｔａ１．Ｃｕｔｔｉｎｇ

ｐｒｏｔｅｉｎ

ｉｓ

ｅｄｇｅ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ．

ａ

ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｂｏｘ一１

ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ

ｃｙｔｏｋｉｎｅ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００６，１７６（１）１１２－１５．

（２３

Ｗａｎｇ

Ｈ，ＬｉａｏＨ，Ｏｃｈａｎｉ

ａｎｄ

Ｍ，ｅｔａ１．Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ

ｓｕｒｖｉｖａｌ

ｉｎ

ａｇｏｎｉｓｔｓｉｎｈｉｂｉｔ

ｓｅｐｓｉｓ

ＨＭＧＢｌｒｅｌｅａｓｅ

ｉｍｐｒｏｖｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ

（Ｊ］．ＮａｔＭｅｄ，２００４，１０（１１）：１２１６－１２２１．

Ｃ３３

ＷｙｋｅｓＭ

ｆａｃｔｏｒ

Ｎ，ＬｉｕＸ

Ｑ，Ｊｉａｎｇ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．Ｓｙｓｔｅｍｉｃｔｕｍｏｒ

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ

ｎｅｃｒｏｓｉｓ

ｇｅｎｅｒａｔｅｄ

ｃｅｌｌ

ｄｕｒｉｎｇ

ｌｅｔｈａｌＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ

ｉｍｐａｉｒｓ

ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ３９８７．

ｆｕｎｃｔｉｏｎＣＪ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９（６）：３９８２—

［４３

显著降低脓毒症大鼠肾组织ＴＮＦ—ａ的基因表达，并改善脏器功能。ｑ们。本研究旨在进一步探讨ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ表达水平影响的分子作用机制。

本资料显示，体外转染进入细胞的ＨＭＧＢｌ可调节２９３Ｔ细胞的ＴＮＦ—ａ基因表达水平。ＨＭＧＢｌ在２００肛ｇ／Ｌ时ＴＮＦ—ａ表达开始增强，３００／ｚｇ／Ｌ达高峰，至５００／ｚｇ／Ｌ时开始减弱，到１５００／ｘｇ／Ｌ时则降低到对照水平。该结果证实了ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ合成具有直接调节效应，说明严重感染后ＴＮＦ—ａ的再次产生可能与ＨＭＧＢｌ延迟释放密切相关；另一方面，本资料也显示，当ＨＭＧＢｌ达到１０００／ｘｇ／Ｌ时，ＴＮＦ—ａ活性开始下降，其确切原因尚不清楚，可能是高浓度ＨＭＧＢｌ对细胞产生了毒性作用。当

３００／ｘｇ／ＬＨＭＧＢｌ与不同片段的ＴＮＦ—ａ报告基因

［９３［５３

Ｊｉａｎｇ

ｉｎ

ｔｈｅ

Ｗ，Ｐｉｓｅｔｓｋｙ

ｒｅｌｅａｓｅ

ｏｆ

ＤＳ．Ｔｈｅ

ｒｏｌｅｏｆｂｙ

ＩＦＮ—ａｌｐｈａａｎｄｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ

２６４．７

ｃｅｌｌｓ

ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ

ＨＭＧＢｌＲＡＷ

ａｃｉｄ

ｏｒ

ｗｉｔｈ

ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ—ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｅ

ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｊ］．

ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００６，１７７（５）：３３３７—３３４３．

Ｂｉａｎｃｈｉ

ＭＥ，Ｍａｎｆｒｅｄｉ

ａｔ

Ａ

Ａ．Ｈｉｇｈ—ｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ

ｂｅｔｗｅｅｎ

ｇｒｏｕｐｂｏｘ１ｉｎｎａｔｅ

ａｎｄ

（ＨＭＧＢｌ）ｐｒｏｔｅｉｎ

ａｄａｐｔｉｖｅ

ｔｈｅ

ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ

Ｒｅｖ，２００７，２２０：３５—４６．

［６］姚咏明，徐珊，盛志勇．高迁移率族蛋白Ｂｌ的组织损伤效应及

其干预途径［Ｊ３．中国医学科学院学报，２００７，２９（４）：４５９－４６５．

［７９

姚咏明，盛志勇．脓毒症信号转导机制的现代认识（Ｊ］．中国危重病急救医学，２００３，１５（１）：３－６．

Ｈ，ＹａｏＹＭ，ＹｕＹ，ｅｔａ１．Ｒｏｌｅ

ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒａｎｄｏｆ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｃ８］Ｌｉｕ

ｏｆ

Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ／ｓｉｇｎａｌ

ｉｎ

ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆ

ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄ

ｐａｔｈｗａｙ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ—ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ

ｒａｔ

ａｃｔｉｖｉｔｙｈｉｇｈ

ｍｏｂｉｌｉｔｙ

ｇｒｏｕｐｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎｌｉｎ

ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ（Ｊ］．

Ｓｈｏｃｋ，２００７，２７（１）：５５—６０．ＵｌｌｏａＬ，ＯｃｈａｎｉＭ，Ｙａｎｇ

ｌｅｔｈａｌｉｔｙｉｎ

Ｈ，ｅｔ

ａ１．Ｅｔｈｙｌｌｅｔｈａｌ

Ｓｃｉ

ｐｙｒｕｖａｔｅｐｒｅｖｅｎｔｓ

ａｎｄ

ｓｙｓｔｅｍｉｃ

ｍｉｃｅｗｉｔｈｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＮａｔｌ

Ａｃａｄ

ｓｅｐｓｉｓ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ

１２３５１—１２３５６．

ＵＳＡ，２００２，９９（１９）：

共同转染细胞并采用内毒素刺激后，观察到１—１２０长度的ＴＮＦ—ａ报告基因活性增加了１２．８４倍，进一步研究发现，在启动子９５—１２０之问的位点可能是ＨＭＧＢｌ作用于ＴＮＦ—ａ启动子的主要作用部位。对此部分碱基分析发现存在一个经典的内毒素作用位点ＮＦ—ＩＬ一６，说明ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ的基因表达调节作用依赖于内毒素的刺激ｎｕ。本实验通过ＨＭＧＢｌ对ＴＮＦ—ａ报告基因活性的剂量效应观察以及对ＴＮＦ—ａ不同片段活性的影响，证实ＨＭＧＢｌ以

，’

＾＾●＾＾●＾●＾●＾＾＾＾＾＾

Ｃ１０３刘辉，姚咏明，于燕，等．大鼠腹腔巨噬细胞高迁移率族蛋白

Ｂ１诱生机制的初步探讨（Ｊ］．解放军医学杂志，２００４，２９（１）：

３９—４１．

（１１）Ｕｅｍａｔｓｕ

ｉｓｏｆｏｒｍ

Ｓ，ＫａｉｓｈｏＴ，ＴａｎａｋａＴ，ｅｔ

ａ１．ＴｈｅＣ／ＥＢＰｂｅｔａ

３４ －ｋＤａ

ｉｎ

ＬＡＰｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒＮＦ－ＩＬ ６ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅ

ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａ

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｂｕｔ

ｉｓｎｏｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒ

ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ５３７８—５３８６．

ｋｉｌｌｉｎｇ［Ｊ３．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９（８）：

（收稿日期：２００８一０１—０７）

（本文编辑：李银平）

，

欢迎订阅２００９年《中国中西医结合急救杂志》

中国科协主管，中国中西医结合学会主办，国家级核心期刊全国各地邮局订阅，邮发代号：６—９３，定价：每期９元，全年５４元２００８年以前的刊物可在本刊社邮购部购买，电话：０２２－２３０４２１５０

刊社地址：天津市和平区睦南道１２２号邮编：３０００５０

‘

．ｔ