高转移潜力食管癌细胞株的建立及其生物学特征

２００７年１２月第１７卷第１２期

ＣＨＩＮＥＳＥ

中国比较医学杂志

ＪＯＵＲＮＡＬ

ＯＦＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ

ＭＥＤＩＣＩＮＥ

Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００７Ｖ０１．１７

Ｎｏ．１２

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高转移潜力食管癌细胞株的建立及其生物学特征

谢仰民１，周

飞２，谢剑君２，蔡唯佳３，许丽艳３，李恩民２

（１．汕头大学医学院实验动物中心；２．生物化学与分子生物学教研室；３．肿瘤病理研究室，汕头５１５０４１）

【摘要】目的建立具有高转移潜力食管癌细胞株并研究其生物学特征。方法将食管癌细胞系ＥＣｌ０９细

胞悬液异位移植到ＳＣＩＤ小鼠胃壁，约３个月后或动物濒临死亡时处死，行病理学解剖，将肉眼可见的纵隔淋巴结

转移瘤块接种于ＳＣＩＤ鼠皮下扩增，然后取小鼠皮下瘤组织块进行细胞培养，得到性状稳定的细胞株ＮＭＣｌ０９后，用

ＭＴＹ法分析细胞生长曲线，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ法检测与细胞分裂增殖能力密切相关的ＴｏｐｏＩＩｅ表达，酶谱法检测ＭＭＰ－２和ＭＭＰ一９的活性，划痕实验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ体外移动实验检测细胞的移动能力。结果

与母本细胞ＥＣｌ０９相比，所获

获

得的细胞株ＮＭＣｌ０９其增殖能力和ＴｏｐｏｌＩｅ表达明显增强，ＭＭＰ－９的活性明显升高，移动能力明显增强。结论得了具有高转移潜力的食管癌细胞株。

【关键词】

食管癌；肿瘤侵袭；肿瘤转移；细胞株

【文献标识码】Ａ

【文章编号】１６７１—７８５６（２００７）１２—０７２７．０４

【中图分类号】Ｒ．３３

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ

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３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｈａｎｔｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｔｏｕ

５１５０４１，Ｃｈｉｎａ）

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｔｕｍｏｒｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ；Ｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；Ｃｅｌｌｌｉｎｅ

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的２％，全世界每年约有２０万人死于

［基金项目］广东省科技厅计划项目（编号２００４８６０３０１００６）。

［作者简介］谢仰民（１９６０一），男，副教授，研究方向：实验动物疾病模型；周飞（１９８１一），男，在读硕士研究生。并列第一作者。［通讯作者］许丽艳（１９６４一），女，研究员；李恩民（１９６３一），男，教授。Ｅ．ｍａｉｌ：ｎｍｌｉ＠ｓｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。

７２８中国比较医学杂志２００７年１２月第１７卷第１２期ＣｈｉｎＪ

ＣｏｍｐＭｅｄ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７，Ｖ０１．１７．Ｎｏ．１２

食管癌，我国是食管癌的高发区，发病率多在４０岁以上，且男性多于女性。目前，食管癌的研究虽然已取得一系列重要进展，但其确切的癌变机理至今尚未明了。侵袭与转移是中晚期食管癌的重要特征，也是影响患者生命和治疗效果的主要原因，控制转移是改善癌症患者预后的主要因素之一。然而目前为止，由于缺乏有效的研究食管癌细胞侵袭与转移的细胞模型，限制了其发生机制和药物筛选的研究。最近我们在ＳＣＩＤ裸鼠上成功建立了食管癌胃壁异位移植模型，并在纵隔淋巴结发现有转移瘤…。为了进一步认识该转移瘤的生物学特性，我们对该转移瘤进行体外培养，分析了其增殖能力和移动能力，成功建立具有高转移潜力的食管癌细胞株。１材料和方法

１．１高转移潜力细胞的筛选

食管癌细胞系ＥＣｌ０９购自中科院上海细胞库，于培养基为ＤＭＥＭ＋Ｆ１２（１：１），小牛血清为１０％，５％ＣＯ，，３７℃，饱和湿度条件下培养。取１×１ｄ７细胞／ｍＬ，接种到ＳＣＩＤ小鼠胃壁，建立食管癌胃壁异位移植模型。取纵膈淋巴结处的转移灶，接种于ＳＣＩＤ小鼠皮下传代扩增；取ＳＣＩＤ小鼠皮下瘤组织块，剪碎至约１ｍｍ３瘤块于含１２％新生牛血清的常规１９９培养基中，置３７℃，５％ＣＯ，，饱和湿度培养，４８ｈ后见组织块周围游离出上皮样细胞后用吸管小心吸出组织块，加入适量新鲜培养基继续培养；然后依次经９６孔和２４孔培养板克隆化后，转至培养瓶中传代培养，２～３ｄ传代１次，待稳定后，进行生物学特征分析。

１．２

ＭＴＴ法检测细胞生长曲线

常规胰酶消化待测细胞后，调节细胞密度至

５．０

Ｘ

１０４／ｍＬ备用，按每孔１００池上述细胞悬液接

种于９６孔板中，每种细胞设９复孔，同时设含１００

皿培养基的孔为空白对照，４８ｈ后加入２０扯ＭＴｒ

（５ｍｇ／ｍＬ）继续培养３～４ｈ，弃尽培养基，每孑Ｌ加入

２００肚Ｌ

ＤＭＳＯ室温溶解１０ｍｉｎ，酶联仪检测各孑Ｌ光吸

收（Ａ）值，测量波长入＝４９０ｎｍ，参考波长入＝６３０ｎｍ，以后每两天检测１次，共检测４次。所得数据用

ＳＰＳＳ

１３．０软件分析，以趸±Ｓ表示，并作细胞生长曲线。

１．３

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测拓扑异构酶Ⅱａ的表达李恩民等幢。曾用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法分析拓扑

异构酶Ｉｋ（ＴｏｐｏｌＩａ）的表达变化来表征细胞增殖情况，本实验按此方法，略作改进。细胞培养至单层

后，ＰＢＳ洗３次，加入适量裂解缓冲液［５０

ｍｍｏｌ／Ｌ

ｒｉｆｆｓ。ＨＣＩｐＨ８．０，１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００，

１００（ｇ／ｍＬＰＭＳＦ］，冰上裂解３０ｍｉｎ，刮下细胞碎片并连同裂解液一同进行４℃，１２

０００

ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后

收获上清，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测蛋白含量后取１００肚ｇ总蛋白上样，１２％ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳和转ＰＶＤＦ膜［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ］。将转好的膜置于５％脱脂奶粉［０．０１

ｍｏｌ／Ｌ

ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］封闭ｌｈ，然后与单克隆抗体ＴＯＰＩＩａ（Ｒｏｃｈｅ）孵育２ｈ，ＰＢＳＴ漂洗２次每次５ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗５ｍｉｎ，加二抗孵育２ｈ，化学发光试剂［Ｓａｎｔａ

Ｃｒｕｚ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ］处理，ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ

ＴＭＩＳ．８９００［ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃ］检测。

１．４酶谱法检测ＭＭＰ．９和ＭＭＰ．２的活性

主要参考Ｘｉｅ等¨。的方法，细胞培养至单层，经无血清培养液漂洗，加入５ｍＬ无血清培养液培养

ｈ后，收集培养上清液５００肚Ｌ，经ＭＹ．１０［Ｍｉｃｒｏｃｏｎ

ＹＭ．１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］浓缩后与２×上样缓冲液［１００

ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ

ｐＨ

６．８，２％ＳＤＳ，０．０２％溴酚蓝，

ｍｉｎ，１２％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ

（含１％明胶）电泳分离，电泳完成后，取下凝胶置洗涤缓冲液（５０

ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２．５％Ｔｒｉｔｏｎ

ｈ，孵育缓冲液（５０

ｍｍｏｌ／Ｌ

７．５，１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ

ＣａＣｌ２）

中３７℃孵育２４ｈ，期间换液１次，最后，０．１％考马斯色，５％乙酸终止，ＦｌｕｏｒＣｈｅｍＴＭＩＳ一８９００［Ａｌｐｈａ按文献［４］的方法，略作改进。胰酶消化处于对Ｘ

１０５，按每

ｈ后倒置显微镜下观测划痕愈合情。

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ体外移动实验

按Ｘｉｅ等ｂ。的方法，略改进。胰酶消化待测细

ＭＬ含１０％

ｈ，擦去小室内表２４

２０％甘油］混匀，３７℃温育３０

Ｘ．１００）中室温下漂洗１Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ亮兰染液染色，脱色液（甲醇：乙酸：水＝４：１：５）脱Ｉｎｎｏｔｅｃ］拍照ｏ

１．５“划痕”法迁移实验

数生长期的待测细胞，调节细胞浓度到１

孔５００肚Ｌ将上述细胞悬液接种到２４孔板中，３７℃，５％ＣＯ：条件下培养至约八成满时，用灭菌的黄枪头轻轻划痕，然后用培养基漂洗３次，继续培养，分别于０、４８、９６况。

１．６

胞后，用含２％小牛血清的培养基终止并调节细胞浓度到１×１０５备用，在２４孔中加入６００小牛血清的培养基，作为趋化物。然后将２００肚Ｌ上述细胞悬液轻轻加入Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室于２４孔板形成的上室中，轻轻混匀，常规培养４８面未穿孔的细胞，固定，Ｇｉｅｍｓａ染色后，镜下计穿过

中国比较医学杂志２００７年１２月第１７卷第１２期

ＣｈｉｎＪＣｏｍｐＭｅｄ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７，Ｖ０１．１７，Ｎｏ．１２

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孔的细胞数。实验重复３次。

２

结果

２．１建立了高转移潜力的细胞株ＮＭＣｌ０９

小鼠纵隔淋巴结处的转移灶，接种至皮下成瘤后，取其瘤块进行培养，４８ｈ后可见组织块边缘游离出细胞，继续培养传代，至５３代时细胞生长稳定（图１）。初步建立了食管癌ＥＣｌ０９细胞系第一代转移性亚系，命名为ＮＭＣｌ０９。

图１第５３代ＮＭＣｌ０９细胞形态（Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜）

Ｆｉｇ．１

Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆ５３ｒｄｐａｓｓａｇｅｏｆＮＭＣｌ０９ｃｅｌｌｓ

（ＯｌｙｍｐｕｓＣＫＸ４１ｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）

２．２

ＮＭＣｌ０９细胞分裂增殖能力明显增强

以ＥＣｌ０９细胞为对照，ＭＴＴ法检测细胞生长曲

线结果显示，接种后２、４和６

ｄ

ＮＭＣｌ０９细胞的生长

速度强于ＥＣｌ０９细胞，且差异有统计学意义Ｐ＝

０．００２０＜０．０５；Ｐ＝０．０００３＜０．０５；Ｐ＝０．０１１０＜０．０５

（图２）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测与细胞分裂增殖密切相关的ＴｏｐｏｌＩａ结果显示，ＮＭＣｌ０９细胞ＴｏｐｏｌＩａ的表达量明显高于ＥＣｌ０９细胞（图３）。

２ｄ

４ｄ

６ｄ

８ｄ

图２细胞生长曲线。统计分析细胞接种后２

ｄ、４ｄ、６ｄ

和８ｄ两种细胞增殖情况：Ｐ＝０．００２０；Ｐ＝Ｏ．０００３；Ｐ＝

０．０１１０：Ｐ＝０．１４９５Ｆｉｇ．２

Ｔｈｅ

ｃｕｒｖｅｓ

ｏｆｔｈｅｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｍｅａｓｕｒｅｄ

ａｔ

２，４，６，８ｄａｙｓ

ａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ．Ｐ＝０．００２０；Ｐ＝０．０００３；Ｐ＝０．０１１０；Ｐ＝０．１４９５

２．３

ＮＭＣｌ０９细胞ＭＭＰ．９活性明显提高

图３

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测Ｔｏｐｏｌｌａ的表达Ｆｉｇ．３

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ

ｗａｓ

ｅｍｐｌｏｙｅｄ

ｔｏ

ａｎａｌｙｚｅｔｈｅ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴｏｐｏｌＩａｉｎｔｈｅｃｅｌｌｓ

明胶酶谱法检测ＭＭＰ２，ＭＭＰ０的活性，在蓝色的凝胶背景中出现无色透明的条带为有酶活性所在部位。实验结果显示，ＮＭＣｌ０９细胞中ＭＭＰ．９酶活性条带明显强于ＥＣｌ０９细胞，但两者ＭＭＰ一２酶活性条带差别不大（图４）。

图４酶谱分析ＭＭＰ－２，ＭＭＰ－９活性

Ｆｉｇ．４

ＺｙｍｏｇｒａｐｈｙｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一２ａｎｄＭＭＰ－９

２．４

ＮＭＣｌ０９细胞移动能力明显增强

以ＥＣｌ０９细胞作对照，划痕迁移实验结果表

明，细胞被划痕后逐渐愈合，并且ＮＭＣｌ０９细胞划痕

愈合能力明显快于ＥＣｌ０９细胞（图５），Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室

检测细胞移动实验显示ＮＭＣｌ０９细胞的移动速率高于ＥＣｌ０９细胞，且差别有统计学意义Ｐ≤０．００５（图６）（图５，６见彩插）。

３讨论

在研究肿瘤转移过程，转移机制，转移性瘤细胞和宿主的相互作用，癌基因及抑癌基因，肿瘤转移的干预治疗实验等均需要合适的转移性瘤细胞系，因

此，转移性瘤细胞系是研究肿瘤转移的最基本的材料，建立转移性瘤细胞系是研究肿瘤转移不可逾越的工作。肿瘤异质性理论认为原发肿瘤是由很多恶

性程度不同的细胞组成的。据此理论，可从肿瘤细

７３０

中国比较医学杂志２００７年１２月第１７卷第１２期ＣｈｉｎＪ

Ｃｏｍｐ

Ｍｅｄ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７，Ｖ０１．１７．Ｎｏ．１２

胞群中将高转移潜力的细胞亚系分离出来，成为转移性瘤细胞系。我们通过裸鼠体内筛选的方法初步得到具有高移动性和高分裂增殖能力的食管癌细胞株ＮＭＣｌ０９。

浸润和转移是食管癌的主要生物学特征，也是食管癌患者主要死亡原因。肿瘤细胞通过基质金属蛋白酶降解细胞外基质及基底膜而发生侵袭和转移，ＭＭＰ．２和ＭＭＰ．９属于基质金属蛋白酶的明胶酶类，可以有效的降解Ⅳ型胶原从而在肿瘤的浸润和转移中发挥重要作用‘５“１。本文的研究表明ＮＭＣｌ０９细胞的ＭＭＰ．９活性明显较其母本细胞ＥＣｌ０９强，提示ＮＭＣｌ０９细胞的高移动能力可能与其ＭＭＰ．９活性增强有关。这也为今后筛选抑制

ＭＭＰ．９活性，进而降低食管癌细胞的侵袭性药物提供了很好的细胞模型。

裸鼠皮下移植模型是研究肿瘤浸润，转移的常用模型，在食管癌的研究中发现此动物模型的最大困难是免疫缺陷动物皮下移植后自发性转移率非常低，仅有０％～４．３％∽。８１；而原位移植法可以提高荷瘤动物的自发性转移率旧。１２｜，但是这种方法应用在食管癌的免疫缺陷小鼠原位移植上困难很大…。因此本研究利用免疫缺陷小鼠胃壁作移植部位进行实验，既解决了技术上的问题，同时又得到了较理想的结果。结合对ＮＭＣｌ０９细胞的体外研究表明，ＥＣｌ０９细胞经免疫缺陷小鼠胃壁筛选一代后就可以得到增殖旺盛和移动能力较强且ＭＭＰ－９活性较高的细胞株。这为今后筛选出高转移食管癌细胞株奠定了基础。

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ｏｆ

ｈｕｍａｎ

ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ

ｂａｓｅｄ

ｏｎ

ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ

ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＩｎｔＪ

Ｇｙｎｅｃｏｌ

Ｃａｎｃｅｒ，２００５，

１５：８５０—８５５．

［修回日期］２００７．０３．３０

时仰民，等．高转移潜力食管癌细胞株的建立及其生物学特征

ＨＥＹａｎｇ－ｍｉｎｌ，ｅｔａ１．ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ

ＨｕｍａｎＥｓｏｐｈａｇｅａｌＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌＬｉｎｅＥＣ１９９

ａ

（正文见第７２７页）

ＣｅｌｌＬｉｎｅｗｉｔｈＨｉｇｈＭｅｔａｓｔａｔｉｃＰｏｔｅｎｔｉａｌＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍ

（Ｆｕｌｌ

ｔｅｘｔｏｎ

ｐａｇｅ７２７）

图５划痕迁移实验。分别于划痕后０ｈ，４８ｈ，９６ｈ拍照记录划痕愈合情况。

Ｆｉｇ．５

Ｗｏｕｎｄ－ｈｅａｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄ

ｔｏ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｗａｓｔａｋｅｎ

ａｔ

０ｈ，４８ｈ，９６ｈａｆｔｅｒｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ．

４如

４∞

３卯

３∞

籁２卯

酒最

２∞

１

如１

∞

∞

０

ＥＣｌ０９

ＮＭＣｌ０９

图６

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室检测细胞移动，实心箭头指穿过膜的细胞，空心箭头指膜上小孑Ｌ。ＮＭＣｌ０９细胞移动

能力明显增强，与对照相比ｐ＝０．００５。

Ｆｉｇ ６

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ

ｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄ

ｔｏ

ｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ａｒｒｏｗｓｓｈｏｗｔｈｅｃｅｌｌｓｔｈａｔｈａｖｅｍｉｇｒａｔｅｄ

ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｈｏｌｌｏｗ－ａｒｒｏｗｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｒｅ．ＴｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＮＭＣ１０９ｃｅｌｌｓｗａｓｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｐ＝０．００５．