云南玛咖种子、块根愈伤组织的诱导培养

氨基酸和生物资源２０１０，３４（３）：５－９

ＡｍｉｌｉｄＡｃｉｄｓ＆Ｂｗｔ／ｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓ

云南玛咖种子、块根愈伤组织的诱导培养

耿树香１，邵华１，王群２

（１．云南省林业科学院云南昆明６５０２０４；２．昆明斯蒙特生物技术有限公司云南昆明６５０２２４；）

摘要：通过对玛咖种子和块根两种外植体愈伤组织初导培养基和增生培养基的筛选及防褐化处理试验，结果表明玛咖种子或根初导培养基最优组合分别为３／４ＭＳ＋３

＋０．３ｍｇ Ｌ“ＮＡＡ＋２５

ｍｇ－Ｌ～６一ＢＡ＋０．３

ｎａｇ Ｌ。ＮＡＡ＋２５

ｇ Ｌ“蔗糖、ＭＳ＋０．３

ｍｇ Ｌ～６一ＢＡ

ｇ Ｌ“蔗糖；其种子和小穗的增生培养基最优组合分别为Ｍｓ＋（０．３—０．５ｍｇ Ｌ。）６一ＢＡ＋０．３

ｍｇ Ｌ～ＮＡＡ；在特定培养条件下，对褐变有一定程度的控制。该研究为玛咖

ｍｇ Ｌ～ＮＡＡ、Ｍｓ＋０．３ｍｇ Ｌ～６一ＢＡ＋０．３

的良种选育提供技术依据。

关键词：玛咖；种子；玛咖根；ＭＳ培养基；愈伤组织培养中图分类号：Ｑ９４

文献标识码：Ａ

文章编号：１００６—８３７６（２０１０）０３—０００５—０５

玛咖（Ｌｅｐｉｄｉｕｍｍｅｙｅｎｉｉ）属于十字花科独行菜属，主要生长在海拔３５００～４５００Ｉｎ的南美安第斯山区，现主要分布在秘鲁中部的Ｐｕｎｏ生态区和秘鲁东南部城市Ｐｕｎｏ…。玛咖主要食用部分为成熟膨大的块根，在南美地区，当地人主要用其作为食物，也作为传统药物使用，具有抗疲劳、改善性功能、提高免疫力、改善妇女更年期症状等多种功效旧Ｊ。云南栽培玛咖含有蛋白质、氨基酸、矿物元素、维生素等

组织生长、分化的影响瞪］，以及华中科技大学生命科学与技术学院的程华，余龙江，胡琼月等以玛咖无菌苗的子叶为外植体进行愈伤组织诱导及形态发生研究ＭＪ。本研究以云南栽培地的玛咖种子与块根作为外植体进行愈伤组织的诱导，为后续的高功效成分的玛咖良种选育以及防止良种退化打下基础。１材料与方法１．１取材与消毒

２００８年１２月从云南玉龙县黄山镇南溪村委会满中村栽培地中选取２００粒种子及１００个块根于４℃冰箱保存备用。

（１）选取饱满、发育完全，污染较轻的种子，经蒸馏水清洗后，用２％～２．５％的ＮａＣＩＯ溶液消毒１５ｍｉｎ，蒸馏水清洗３次后，用淡红色的高锰酸钾水溶液浸泡催芽１２—１６ｈ。接种前，在超净工作台上再用２０％的ＨｇＣｌ：溶液消毒３０ｍｉｎ，用无菌水清洗５次后接种。消毒时，加３～４滴吐温作表面活化剂，并摇动，使材料能均匀消毒。（２）块根用自来水冲洗干净，切块（１

ｅｍ×１

多种营养成分，脂肪含量很低，其中蛋白质、钙、铁、

Ｖ，等对人体十分有益的成分较高，不饱和脂肪酸占脂肪酸的比例较高，其它成分基本类似，说明云南栽

培玛咖在营养成分方面与秘鲁产玛咖无本质区别，

可以作为食品及保健品开发利用¨Ｊ。我国目前的玛咖原料来源于秘鲁，由于原料需要进口，导致了玛咖产品的价格较高，且产品有限。云南为多山地区，全省９４％以上的土地为山地和高原ＨＪ，气候类型复杂，气候和山地资源丰富，为山区发展玛咖种植奠定了很好的基础，在适宜地区发展玛咖可为当地提供一种新的食物资源。

受生长环境限制，现有玛咖产量已无法满足日益增长的市场需求。通过植物组织培养快速繁殖和细胞大规模培养技术研究，扩大玛咖适宜种植区域和进行有效成分提取分离是解决玛咖供需矛盾的重要途径。迄今为止，对玛咖的研究主要集中在成分分析和药理学作用两方面，对组织培养的系统研究少见报道。仅有中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室王亚丽，王晓东等研究了光质对玛咖愈伤

收稿只期：２０１０一０４—２１

作者简介：耿树香，女（１９７８一），助理研究员，主要从事林产化工研究。课题来源：云南省科技厅资助项目

ｃｍ大小），蒸馏水清洗３次

ｍｉｎ，

后，在超净工作台上再用７５％的酒精浸泡０．５次后接种。

１．２

以２０％的ＨｇＣｌ：溶液消毒３０ｍｉｎ，用无菌水清洗５

两种外植体愈伤组织初导培养基的筛选影响玛咖愈伤组织产生的因素很多，如所取的外植体，基本培养基的种类，６一ＢＡ的用量，蔗糖的用量，ＮＡＡ的用量，培养基的ｐＨ值等。

采用改良ＭＳ、３／４ＭＳ和１／２Ｍｓ（大量元素的用量为全ＭＳ的３／＇４，其他母液的用量不变。１／２

ＭＳ

类推）做基本培养基，加入不同浓度的生长物质（ＢＡ

６

耿树香等：云南玛咖种子、块根愈伤组织的诱导培养

或ＮＡＡ），外加２０～３０ｇ Ｌ。１蔗糖为碳源，凝固剂琼脂为５．８～６．５ｇ Ｌ～，ｐＨ值为５．８～６．２。

用正交试验选择最优组合，用４因素３水平的ｋ（３４）正交表安排此实验，（见表１）。用极差分析选择试验参数。选择玛咖种子及块根愈伤组织诱导的主要影响因素及最适初导培养基。

表ｌ

正交试验因素水平表

种诱导培养基和选择合适的外植体。已诱导出愈伤组织并褐化的玛咖种子有１６瓶，块根的为２０瓶，每瓶４个材料，在不同培养基中进行增生培养，并对已褐化的玛咖愈伤组织进行防褐化研究。２结果与分析

２．１初导培养基筛选结果与分析

正交试验及分析结果见表２，表２中，由极差计

幽

水平改良Ｍ

Ａ

１２３

ｌ３／４１／２

塞

‘Ｌ

ｓ．６一－．Ｂ—Ａ，Ｎ—Ａ。Ａ／ｍｇ

’

Ｌ／ｍｇ

ｔ／，ｇ嚣尝－

’Ｌ

算公式：Ｒｊ＝ｍａｘ（巧ｌ＆，……‰）一ｍｉｎ（晦＆，……‰）计算得Ｒ值，比较玛咖种子各Ｒ

值，Ｒ。＞Ｒ．＞Ｒ。＞Ｒ。，所以因素对试验指标影响的主次顺序为Ｂ＞Ａ＞Ｃ＞Ｄ，即：６一ＢＡ用量＞改良ＭＳ＞ＮＡＡ用量＞蔗糖用量。而玛咖块根各Ｒ值中Ｒ。＞Ｒ。＞Ｒ。＞Ｒ。，所以因素对试验指标影响的主次顺序为Ｂ＞Ｃ＞Ａ＞Ｄ，即：６一ＢＡ用量＞ＮＡＡ用量＞改良ＭＳ＞蔗糖用量。

Ｋｊｉｎ为第ｊ列因素Ｉｌｌ水平所对应的试验指标和。从表２中可得玛咖种子初导培养基中Ａ：、Ｂ：、ｃ２、Ｄ２分别为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ的优水平。而Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ，４因素的优水平组合Ａ：Ｂ：ｃ：Ｄ：为最优水平组合，即种子初导培养基为３／４ＭＳ＋０．３

０．３ｍｇ Ｌ。１ＮＡＡ＋２５

ｍｇ Ｌ～６一ＢＡ＋

ＢＯ．２０．３０．４

Ｃ０．３０．５１．０

Ｄ２０２５３０

注：ＭＳ—Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｓｋｏｏｇ；６一ＢＡ一６一苄基腺嘌呤；ＮＡＡ一萘乙酸，下表同

１．３

两种外植体愈伤组织增生培养基的筛选及防诱导玛咖愈伤组织的基本培养基经正交实验选

褐化研究

择后进一步进行玛咖愈伤组织的增生培养，并选择合适的愈伤组织增生培养基。把消毒好的玛咖外植体（种子及块根）于同一天分别接种在６种培养基内，种子的为４８瓶；块根的为４０瓶；每瓶４个材料。

接种后放入２６４－２℃恒温培养箱中进行暗培养。每隔１５ｄ继代一次，较大的愈伤组织切离外植体，接种到增生培养基上。继代培养８代左右，分别调查各不同培养基愈伤组织出现的天数，以比较各

ｇ Ｌ。１蔗糖。而玛咖块根的

初导培养基中Ａ，、Ｂ：、ｃ：、Ｄ：分别为Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ的优

水平。而Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ４因素的优水平组合Ａ。Ｂ２Ｃ：Ｄ：为最优水平组合，即玛咖块根愈伤组织的初导培养基的最佳配方为ＭＳ＋０．３

Ｌ“ＮＡＡ＋２５

ｍｇ Ｌ～６一ＢＡ＋０．３ｍｇ

ｇ Ｌ一１蔗糖。

表２正交试验结果与分析

兰兰

ｌ２３４５６７８９

矗ｈ铷

堕基丛璺（垒２

ｌ（１）１（１）

固塞查垩

鱼二旦堂塑ｇ：坠：！（旦２盟垒笪尘ｇ：坠：！（ｇ２蓝碰ｇ：垦：！（旦）

ｌ（Ｏ．２）２（ｏ．３）

出愈／％

弛至（迭塑２

５４．５（４８．２）７０（５５．２）

１（０．３）

２（０．５）

ｌ（２０）２（２５）

３（３０）３（３０）１（２０）２（２５）２（２５）３（３０）１（２０）

ｌ（１）

２（３／４）２（３／４）２（３／４）３（１／２）３（１／２）３（１／２）

３（０．４）

１（Ｏ．２）２（Ｏ．３）３（０．４）ｌ（０．２）２（０．３）３（０．４）

３（１．０）

２（０．５）３（１．Ｏ）ｌ（ｏ．３）

６６．２（４７．４）

６７．５（４８．１）６９．５（４８．９）６９．２（４８．６）６５．３（４５．２）６９（５１．４）

３（１．０）ｌ（０．３）

２（０．５）

６８．３（４８．０）

＆

Ｋ４

１９０．７（１５０．８）

２０６．２（１４５．６）

１８７．３（１４１．５）

２０８．５（１５５．５）

１９２．７（１４８．２）

２０５．８（１５１．３）

１９２．３（１４５．１）

２０４．５（１４９）２０２．７（１４６．９０）

知

＆

Ｋ口

２０２．６（１４４．６）

６３．６（５０．３）６８．７（４８．５）

２０３．７（１４４．Ｏ）

６２．４（４７．２）６９．５（５１．８）６７．９（４８．０）Ｂ２（Ｂ２）

２０ｌ（１４１．５）６４．２（４９．４）

６８．６（５０．４）６７（４７．２）ｃ２（Ｃ２）

６４．１（４８．４）

６８．２（４９．７）６７．６（４９．０）Ｄ２（Ｄ２）

～

优水半

当

６７．５（４８．２）

Ａ２（Ａ１）

５．１（２．１）

７．１（４．６）４．４（３．２）４．１（１．３）

．一一

圭达躯庄

壁王三坠垒生望

丛堡三堡垒垒望

备注：出愈率为愈伤组织出现的百分率＝出现愈伤组织的接种材料数／接种材料总数×１００％。

氨基酸和生物资源

７

在表２玛咖愈伤组织增生培养基中添加ＮＡＡ，易使愈伤组织基部变黑，使愈伤组织的增生受到一定程度的抑制，因此，诱导愈伤组织产生的关键主要不在于生长素与细胞分裂素的比例，而在于选择合适浓度的６一ＢＡ。虽然６一ＢＡ在０．３～１．０ｍｇ Ｌ“浓度范围内都能诱导愈伤组织产生，但对于愈伤组织的形成及愈伤组织的质地都宜采用较低浓度的６一ＢＡ。一般采用ＭＳ＋０．３

ｍｇ Ｌ一６一ＢＡ＋０．３ｍｇ

褐化研究结果与分析

在表３中：使用不加６一ＢＡ，只加细胞生长素

ＮＡＡ（０．２—０．５ｍｇ Ｌ一）的ＭＳ基本培养基，均没

有愈伤组织的出现；另外，用不加任何细胞生长素、只加６一ＢＡ（０．３ｍｇ Ｌ。）进行试验，２周后出现愈伤组织。由此看来细胞生长素对玛咖种子愈伤组织的诱导并非必不可少。对块根，６一ＢＡ为０．３～０．７ｍｇ Ｌ。１的浓度范围内，在１５—３０ｄ内都可诱导出愈伤组织，而且接种几周后，所产生的愈伤组织百分率接近，种子的为９０．０％，块根的为９１．５％。

Ｌ—ＮＡＡ作为玛咖愈伤组织的基本培养基。２．２两种外植体愈伤组织增生培养基的筛选及防

表３玛咖愈伤组织增生培养结果

不同玛咖外植体及不同培养基产生的愈伤组织颜色质地不同。表４中，玛咖种子为外植体、基本培养基为ＭＳ＋（０．３—０．５ｍｇ Ｌ一１）６一ＢＡ＋０．３

ｍｇ

６一ＢＡ及ＮＡＡ结合使用所诱导出的愈伤组织质地不好，均有不同程度的褐变。所以对于玛咖不同外植体诱导其愈伤组织产生的最适基本培养基不同，种子与块根的愈伤组织增生培养基分别是ＭＳ＋（０．３～０．５ｍｇ Ｌ一１）６一ＢＡ＋０．３

ｍｇ Ｌ一１ＮＡＡ、

ＭＳ＋Ｏ．３ｍｇ Ｌ一１６一ＢＡ＋Ｏ．３ｎａｇ Ｌ一１ＮＡＡ。

Ｌ—ＮＡＡ所产生的愈伤组织为白至黄白色，质地疏松，易碎颗粒；块根为外植体、培养基为ＭＳ＋０．３

ｍｇ Ｌ～６一ＢＡ＋０．３

ｍｇ Ｌ—ＮＡＡ所产生的愈伤

组织为白至黄白色，质地疏松；其它培养基不同浓度

表４两种外植体愈伤组织增生培养基筛选结果

供试材料种子

培养基

Ｍｓ＋（０．３—０．５ｍｇ Ｌ一）６一ＢＡ＋Ｏ．３ｍｇ Ｌ—ＮＡＡ

愈伤组织质地及色泽

愈伤组织白到黄白色，质地疏松

在表５中，对已褐化的玛咖愈伤组织去除褐化部分进行增生培养，在增生培养基中虽然改善了愈伤组织培养的营养环境，但增生效果并不理想。其原因是玛咖含活性成分多、氧化而引起愈伤组织褐变问题。开始是接触培养基的基部开始变褐变黑，使愈伤组织块从白色渐转灰褐或黄褐色，并向周围的培养基扩散，直至整瓶培养基呈褐色，对细胞起毒害作用，愈伤组织随着黑褐部分向上蔓延，整块变黑

死亡。

及时切去黑褐部分，不断更新培养基，虽然可在一定程度上保持愈伤组织有活力的部分，但增生部

分与需切去部分总是差不多，使愈伤组织长期增长

不显著。为防止褐变，在培养基中加入吸附剂活性炭，只能减轻褐变而不能完全控制褐变，且加入活性

炭的各种培养基中，愈伤组织增生效果均不理想，可能是由于活性炭的连续使用，在吸收酚类等有害物

８ 耿树香等：云南玛咖种子、块根愈伤组织的诱导培养

质的同时，也大龟地吸收了对愈伤组织有用的成份，影响愈伤组织的增生。由于愈伤组织生长不良，更易于竭变。

在表５中，玛咖两种外植体愈伤组织的诱导培

表５

养均在２５—２６℃暗条件下培养。是因为在暗培养条件下，一些光诱导参与酚类合成和氧化的酶活性减弱，导致酚类合成减少，其氧化物醌类也相应减少，使褐变得到一定程度的控制。

防褐化物质对愈伤组织诱导的效果比较

备注：褐变率为褐化组织出现的白．分率＝新出现褐化愈伤组织的接种材料数／接种材料总数×１００％。基本培养摹均为ＭＳ＋２５９ Ｌ。１蔗糖＋６．５％琼脂。Ｍｓ为Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ；６一ＢＡ为６一苄基腺嘌呤，ＫＴ为激动素（６一呋喃氮基嘌呤）；ＣＷ为椰乳。

由于玛咖的块根比较复杂，含有的微生物也较多，所以块根的污染率比种子的污染率高。一般会发现在块根的基部开始出现黄色的絮状污染物，以后污染物会逐渐扩散，导致外植体死亡。或者在块根上出现白色的菌丝，最终导致块根的死亡。在块根的愈伤组织诱导出现并已开始变黄时需要马上接人新的培养基中，否则容易变褐死亡。待愈伤组织长大以后，再对其进行切断，进行增值培养，并且可以在同一培养基中放入多块愈伤组织。这样生长效果更好。３结语

３．１

６一ＢＡ是比较适合玛咖诱导愈伤组织的生长调节剂。

３．２温度对愈伤组织的诱导有明显的影响。在低温下，诱导率低，生长较慢；高温下，诱导率较高，生长快，ｆ日高温下培养的明显比低温下培养的褐化程度要高，这是由于与褐化有关的多酚氧化酶等玛咖成分的活性在高温时比较高。

３．３

光照也是影响玛咖愈伤组织诱导的一个关键

因素，选择合适光照对愈伤组织诱导极为重要。在暗培养条件下玛咖愈伤组织诱导率高，基本不褐化；光培养条件下愈伤组织诱导率高长势旺盛，但褐化严重。是由于光照可以增强多酚氧化酶的活性。

综上所述，对于玛咖不同外植体诱导其愈伤组织产生的最适培养基不同，种子与块根的分别是３／

４ＭＳ＋（０．３—０．５ｍｇ Ｌ一１）６一ＢＡ＋０．３ｍｇ Ｌ一１

ＮＡＡ、ＭＳ＋Ｏ．３ｍｇ Ｌ－１６一ＢＡ＋０．３ｍｇ Ｌ一１ＮＡＡ。

结果表明激素组合不同，玛咖愈伤组织的诱导

率有差异。在无６一ＢＡ时无法诱导出愈伤组织；在６一ＢＡ与ＮＡＡ的组合中，６一ＢＡ（０．２～１．０

ｍｇ

Ｌ’１）＋ＮＡＡ（０．２～１ｍｇ Ｌ一）都能诱导出愈伤组织，不同外植体诱导其愈伤组织产生的最适基本培养基不同，种子与块根的分别是３／４ＭＳ＋（０．３～

０．５ｍｇ。Ｌ一１）６一ＢＡ＋０．３ｍｇ Ｌ一１ＮＡＡ、ＭＳ＋０．３ｌＩｌｇ。Ｌ一６一ＢＡ＋０．３

置于２５～２６℃暗培养条件下适合玛咖种子和块根愈伤组织诱导，愈伤组织长势旺盛，褐化程度低，诱导周期短，愈伤组织诱导率达１００％（去除受污染及死亡的外植体）。

ｍｇ Ｌ‘。ＮＡＡ。其愈伤组织诱

导率达１００％（去除受污染及死亡的外植体）。说明

氨摹酸和生物资源

９

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ＧＥＮＧＳｈｕ—ｘｉａｎ９１，ＳＨＡＯ

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Ａｃａｄｅｍｙ

Ｈｕａｌ，ＷＡＮＧＱＵＢ２

６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）

ｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２０４；２．ＭｅｎｇｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．Ｋｕｎｍｉｎｇ

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ＮＡＡ＋２５ｇ．Ｌ一１ｓｕｃｒｏｓｅ．ＭＳ＋０．３ｍｇ Ｌ一１６一ＢＡ＋０．３ｍｇ Ｌ一１ＮＡＡ＋２５ｇ Ｌ一１ａｔｉｏｎｏｆｓｅｅｄａｎｄｓｐｉｋｅｌｅｔｏｐｔｉｍａｌｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉａｗｅｒｅＮＡＡ．ＭＳ＋０．３ｍｇ Ｌ一１６一ＢＡ＋０．３ｍｇ Ｌ一１

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ｍｅｙｅｎｉｉ（Ｍａｃａ）；ｓｅｅｄ；ｒｏｏｔ；ＭＳ

ｍｅｄｉｕｍ；ｃａｌｌｕｓｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ