七株盐藻的亲缘关系鉴定和生长特性比较

中国海洋大学

硕士学位论文

七株盐藻的亲缘关系鉴定和生长特性比较

姓名：姜玮

申请学位级别：硕士

专业：动物学

指导教师：李赟

20090601

七株盐藻的亲缘关系鉴定和生长特性比较

摘要

本论文选用中国海洋大学微藻种质库保存的７株盐藻为研究材料，对其进行了盐度、温度以及光照等生态因子的适应性评价，结合传统细胞学形态分类和分子生物学手段进行了分类地位和亲缘关系的探讨，为进一步研究和开发这一藻类资源提供依据。本研究还初步研究了盐藻的耐盐蛋白，并应用流式细胞术这一新技术进行了盐藻耐盐机理研究方法的初步尝试。研究结果如下：

１．在本实验条件下，这７株盐藻对温度和光照强度的适应性相似，最佳生长条件分别为２５。Ｃ，６０００１ｘ。盐度适应实验结果表明７株盐藻均为耐盐品系，但其耐盐性存在显著差异，相对最适盐度为５０＂－１５０不等，其中以Ａ５７对高盐度的耐受性最强。在优化的盐度、温度及光照条件下，Ａ８５增殖能力较强，具有一定的开发潜力。

２．ＰＣＲ扩增７株盐藻的５．８ＳｒＤＮＡ和ＩＴＳ序列，并完成序列测定，将从Ｇｅｎｂａｎｋ搜索的７条已定种盐藻的相应序列与７条扩增序列同时进行分析，构建进化树，得出７株盐藻均与绿色杜氏藻（Ｄ．ｖｉｒｉｄｉｓ）亲缘关系最为密切，结合细胞形态学及生理生化分析的鉴定结果，可以确定这７株盐藻均为绿色杜氏藻的不同株系，其中Ａ８５、Ａ５７和Ａ８３亲缘关系最近，Ａ１２１和Ａ１２４关系最为密切。筛选的１２个随机引物进行７株盐藻ＲＡＰＤ分析的结果与采用５．８ＳｒＤＮＡ和ＩＴＳ序列分析的结果基本一致。

３．测定高盐胁迫下盐藻Ａ５７的胞内甘油含量并提取总蛋白进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析，发现其细胞胞内甘油含量的调整在高盐胁迫６ｈ内即可完成，但蛋白合成在胁迫初期受到显著抑制，胁迫持续至３周，一些功能蛋白的表达被明显诱导，表达强度是对照３倍以上或接近３倍的蛋白有７５ＫＤ、７０ＫＤ、１５ＫＤ蛋白，近２倍的蛋白有２６ＫＤ、３６ＫＤ和４０ＫＤ，同时，５４ＫＤ和１０８ＫＤ的蛋白则在高盐胁迫时被显著抑制。

４．采用ＦＤＡ．ＰＩ双染色的方法，应用流式细胞仪检测Ａ５７在盐度胁迫下的细胞活力、形态学变化，分析结果表明，高渗胁迫初期，细胞内容物含量迅速下降，体积增大，膜损伤细胞比例在６ｈ内迅速升高，至２４ｈ保持稳定。关键词：盐藻，盐度，温度，光照，ＲＡＰＤ，ＩＴＳ，流式细胞术

Ａｂｓｔｒａｃｔ

ＳｅｖｅｎｓｔｒａｉｎｓｏｆＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．ｐｒｅｓｅｒｖｅｄｉｎＭｉｃｒｏａｌｇａｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，ｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｓｕｂｊｅｃｔｏｆｓｔｕｄｙ．Ｔｏｓｔｕｄｙａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｓｅｍｉｃｒｏａｌｇａｅ

ｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓａｌｉｎｉｔｙ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ

Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ７ｓｔｒａｉｎｓｏｆａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅａｌｓｏｕｓｅｄｉｎｔｈｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔａｘｏｎｏｍｉｃｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｔｈｅａｎｔｉ—ｓａｌｔｍｅｔａｂｏｌｉｓｍＷａｓｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ：

１．Ｓｅｖｅｎｓｔｒａｉｎｓｈａｄｓｉｍｉｌａｒａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙｔｏｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｕｎｄｅｒ２５℃，６０００１ｘ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｉｒｓａｌｉｎｉｔｙｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｓａｌｉｎｉｔｙｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ５０ｔｏ１５０，ａｎｄＡ５７ｗｅｒｅｔｈｅｂｅｓｔｏｎｅ．Ａ８５ｇｏｔｔｈｅｂｅｓｔｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．

２．Ｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍｅ５．８ＳｒＤＮＡａｎｄＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｓｅＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．ｗｅｒｅ

ｗｉｔｌｌｔｈｅ７ＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｒｏｍＧｅｎｂａｎｋ．ＵＰＭＧＡ

ｓｅｖｅｎｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔａｌｌｔｈｅＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｔｒａｉｎｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｈｅｓａｍｅ

ｃｌａｄ、杭ｔｌｌＤｕｎａｌｉｅｌｌａｖｉｒｉｄｉｓ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇｔｈｅａｐｐｒａｉｓａｌｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃ”ｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅｓｔｕｄｉｅｄＤｕｎａｌｉｅｌｌａｓｔｒａｉｎｓｍｉｇｈｔｂｅｌｏｎｇｔｏＤ．ｖｉｒｉｄｉｓ．Ｗｉｔｈｉｎ

ｃｌａｄ，ｗｈｉｌｅＡ１２１ｔｈｅ７ｓｔｕｄｉｅｄｓｔｒａｉｎｓ，Ａ８５ａｎｄＡ５７ａｎｄＡ８３ｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｔｏａ

ａｎｄＡ１２４ｗｅｒｅｃｌｕｓｔｅｒｅｄｔｏａｎｏｔｈｅｒｃｌａｄ，ｗｈｉｃｈｗａｓｆｕｒｔｈｅｒｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＲＡＰＤａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇ１２ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒｓ．

ｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡ５７ｇｒｏｗｎｉｎｈｙｐｅｒｓａｌｉｎｅ３．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｇｌｙｃｅｒｏｌｍｅｄｉｕｍｉｎｄｉｃａｔｅｄ

ｔｈａｔｔｈｅａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌｃｏｎｔｅｎｔｆｉｎｉｓｈｅｄｉｎ６ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｓｈｏｃｋ．Ａｆｔｅｒｔｈｒｅｅｗｅｅｋｓ，ｓｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄ７５ＫＤ，７０ＫＤ，１５ＫＤ，ｗｈｏｓｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｐｒｏｔｅｉｎｔｗｏａｍｏｕｎｔｓｅｎｈａｎｃｅｄｎｅａｒｌｙｔｉｍｅｓ；ｐｒｏｔｅｉｎ２６ＫＤ，３６ＫＤ，４０ＫＤ，ａｌｍｏｓｔｄｏｕｂｌｅｄ，ｗｈｉｌｅ

１０８ＫＤｗｅｒｅｓｔｒｏｎｇｌｙｒｅｓｔｒａｉｎｅｄ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎ５４ＫＤ，

４．ＡｐｐｌｉｅｄＦＤＡ－ＰＩｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈＦＣＭｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆＡ５７ａｆｔｅｒｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃｓｈｏｃｋ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ

ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｔｅｎｔｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｑｕｉｃｋｌｙａｔｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔａｇｅ，ｗｈｉｌｅｃｅｌｌｖｏｌｕｍｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅｎｏｎｖｉａｂｌｅｃｅｌｌｐｅｒｃｅｎｔｒｉｓｅｄｅｖｉｄｅｎｔｌｙｉｎ６ｈｏｕｒ，ａｎｄｒｅｍａｉｎｅｄｓｔａｂｌｅｕｎｔｉｌ２４ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒｔｈｅｓｈｏｃｋ．

Ｋｅｙｗｏｒｄ：Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ，ｓａｌｉｎｉｔｙ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＲＡＰＤ．ＩＩＳ．Ｆ伽

独创声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

学位论文作者签名：羞弗签字日期：如宁年６月ｆ日

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学位论文作者签名：差弗

签字日期：细７年６月ｆ日导师签字：斗支《’６月］日）签字日期：