活细胞线粒体中SO2-3HSO-3的荧光成像

Vol.352014年12月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 高等学校化学学报 2534~2541No.12 doi:10.7503/cjcu20140542

-活细胞线粒体中SO2-/HSO33的荧光成像

姜 娜,樊江莉,张 帅,彭孝军

(大连理工大学精细化工国家重点实验室,大连116024)

摘要 在五甲川菁染料的基础上,合成了一种新型的中位溴取代的五甲川菁染料Cy5-Br,其结构通过质谱和核磁共振波谱表征.性能测试结果表明,该染料作为荧光探针的发射波长可达665nm,具有较低的细胞毒

-性,而且对二氧化硫衍生物SO2-3和HSO3具有很好的选择性.该探针在665nm处的荧光发射强度随着

-2-SO2-3/HSO3浓度的增加不断降低,具有良好的线性荧光响应.Cy5-Br可以进入活细胞线粒体,对SO3和

HSO-3的浓度进行实时共聚焦荧光成像.

关键词 亚硫酸根;亚硫酸氢根;线粒体;荧光成像

中图分类号 O657 文献标志码 A

-H2SO3,再通过水解作用最终形成衍生物SO2-3和HSO3.医学研究表明,暴露在过量的二氧化硫环境中二氧化硫是常见的气体污染物,通过呼吸作用吸入的二氧化硫很容易在呼吸系统内与水结合生成

不仅会刺激呼吸系统,还会导致肺癌、神经错乱及心血管等疾病[1,2].二氧化硫的毒性主要是由SO2-3

-物体内亚硫酸盐(SO2-3和HSO3)的含量具有重要的生物学和医学意义.[3]和HSO-,因此亚硫酸盐的用量在很多国家都有严格的控制标准.例如3这2种亚硫酸盐衍生物体现

美国食品添加剂专家联合委员会建议人体每日亚硫酸盐允许摄入量应低于0.7mg/kg[4,5].因此检测生

目前,检测亚硫酸盐的方法有高效液相色谱法、电化学分析法和离子色谱法等[6],这些方法存在

-[3,9~14]近年来,一些能够应用于检测亚硫酸盐(SO2-,该类探针主3和HSO3)的荧光探针已见报道设备昂贵、操作复杂(如样品需预处理)及灵敏度低等不足.荧光分析法因具有较高的灵敏度,方便快捷等优点,近年来在生物化学、医学分析和环境监测等方面受到广泛的关注[7,8].

-要基于SO2-3和HSO3对醛基和乙酰丙酸类物质的专一性反应.但是,基于醛基的加成反应通常需要在

酸性条件下进行,并有可能受到半胱氨酸和高半胱氨酸的影响;而乙酰丙酸型探针中的酯链有可能被蛋白酶等分解,因此在生物成像过程中会产生较高的背景干扰信号.Guo等[3]报道了一种利用香豆素

-[15]半花菁染料共轭链上的α,β-不饱和结构与SO2-的荧光探针,该探针不仅检测3/HSO3发生加成反应

条件温和,而且首次实现了亚硫酸盐在活细胞内成像.另一方面,线粒体是细胞“能量工厂”,几乎存在于所有的真核细胞内,参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程,并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力.线粒体内亚硫酸盐含量异常会影响其功能进而导致机体疾病的发生.例如在小白鼠的海马趾神经元中,二氧化硫及其衍生物能够改变钠和钾离子的通道功能,打破细胞内的氧化还原平衡,对机体造成伤害.迄今,能够定位于线粒体的该类探针尚未见报道.

具有良好的生物应用前景[16,17].由于线粒体表面存在-180mV的膜电位,使得苄基苯并噻唑季铵盐修饰的染料能够选择性定位于线粒体[18,19].本文选取五甲川菁染料为母体,合成了一种中位溴取代,苄五甲川菁染料(Cy5)的吸收波长和发射波长在650~700nm之间,是波长最短的近红外菁染料,基苯并噻唑季铵盐修饰的荧光染料Cy5-Br,其发射波长接近近红外区[在V(PBS)颐V(CH3CN)=8颐2,-pH=7.4体系中其荧光发射波长为665nm].实验结果表明,该探针不仅可在体外检测SO2-3和HSO3,

收稿日期:2014-06-13.网络出版日期:2014-10-17.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:21136002)、教育部新世纪优秀人才支持计划(批准号:NCET-12-0080)、辽宁省自然科学基金(批准号:2013020115)和中央高校基本科研业务费资助项目(批准号:DUT14ZD214)资助.

联系人简介:樊江莉,女,博士,副教授,主要从事荧光染料的合成与应用研究.E-mail:fanjl@http://wendang.chazidian.com

No.12 -姜 娜等:活细胞线粒体中SO2-3/HSO3的荧光成像2535还能够定位于活细胞中的线粒体,对线粒体内亚硫酸盐的含量实现实时荧光成像.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂INOVA400型(400MHz)核磁共振仪(美国Varian公司,以TMS为内标);HP1100LC/MSD质谱仪及HP-8453型紫外-可见分光光度计(美国HP公司);RF5000型荧光分光光度计(日本岛津公司);PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂);奥林巴斯V10-ASW激光共聚焦荧光显微镜.荧光量子产率所用的基准染料罗丹明B为Acros公司高纯试剂.除溴化苄为Acros公司产品外,其它合成用原料均为经再提纯的国产工业品或国产分析纯试剂,其中部分原料和溶剂经过纯化或干燥处

1.2 中间体及目标产物的合成

化合物Cy5-Br的合成路线如Scheme1所示

.理后再使用.

Scheme1 SyntheticroutesofCy5-Br

1.2.1 溴化(1-苄基-苯并噻唑盐)(1)的合成 在氮气保护下,将0.85g(5mmol)2-甲基苯并噻唑和停止加热.待混合液冷却至室温后,过滤沉淀并用乙醚洗涤滤饼,干燥后得到1.9g灰白色的固体粉末,粗收率81%.产品未经进一步纯化,直接用于下一步反应.0.90g(6mmol)苄溴于60~70℃反应(不需要添加溶剂).反应中生成大量灰白色固体,反应3h后,1.2.2 缩合剂2-溴丙二醛二苯胺(2)的合成 取1.3g(5mmol)2,3-二溴丁烯醛酸加入到盛有10mL无水乙醇的两口烧瓶中,搅拌使其溶解后,装上冷凝装置.另取0.9g(10mmol)苯胺溶于5mL无水乙醇中,常温搅拌下滴入两口瓶中,溶液颜色很快由无色变成黄绿色,产生大量气泡,并且放出大量的热导致溶剂回流,加毕继续搅拌1h,逐渐冷却,析出黄色固体,过滤后用乙醇重结晶得到纯的缩合剂,干燥后得到产品0.72g,收率48%.1.2.3 Cy5-Br的合成 取0.32g(1mmol)化合物1和0.13g(0.05mmol)化合物2,加入到单口烧瓶中,再加入0.17g(2mmol)无水醋酸钠和100mL乙醇,搅拌使其溶解后,装上冷凝装置.在氮气保护下加热到100℃,溶液很快变为蓝色,反应30min后停止加热,自然冷却至室温.用饱和食盐水洗涤,用二氯甲烷多次萃取,然后用无水硫酸钠干燥,旋转蒸干溶剂,残留液用少量二氯甲烷溶解,经硅胶金属光泽的蓝色染料Cy5-Br0.56g,产率84%.化合物Cy5-Br的1HNMR及13CNMR谱图分别见图S1和图S2(见本文支持信息).1HNMR(400MHz,MeOD),δ:7.90(q,2H),7.72(d,J=8Hz,1H),7.56(t,J=7Hz,1H),7.37(q,3H),7.27(d,J=7Hz,2H),6.47(d,J=12Hz,1H),5.63(s,2H),色层析分离纯化,用无水甲醇/二氯甲烷(体积比1颐40)展开剂冲洗,收集蓝色组分,蒸干后得到带有

2536高等学校化学学报 Vol.35

131.31(s,1H).128.20,126.47,125.82,122.61,113.51,100.36,49.46.HRMS-ESI(M+)calcd.forC33H26N2BrS+2,

1.3 性能测试实验m/z593.0715;found:593.0728.

1.3.1 荧光量子产率的测定 将Cy5-Br用二甲基亚砜(DMSO)溶解并于5mL容量瓶中定容,制成1mmol/L的染料母液.测试时,用母液配制浓度为5μmol/L的不同溶剂的溶液,在紫外-可见和荧光分光光度仪上分别测定其吸收光谱和荧光发射光谱,记录最大吸收波长、发射波长以及最大吸收波长处的吸光度.将溶液稀释至吸光度在0.06~0.08之间,测定其发射光谱,并计算染料在该溶剂中的荧光量子产率,公式如下:

Φx=Φs(Fx/Fs)(As/Ax)(λex,s/λex,x)(nx/ns)2CNMR(400MHz,MeOD),δ:174.37,166.14,147.40,141.81,133.80,129.05,

式中,Φ是荧光量子产率;F是荧光光谱积分面积;A是激发波长处的吸光度;λex是激发波长;n为溶液的折射率(溶液在低浓度下其折射率用溶剂的折射率代替);下标x和s分别代表待测样品和参考

1.3.2 饱和滴定实验 取15μL探针母液,加入含有3mL10mmol/LPBS-CH3CN(体积比8颐2,10mmol/LNa2SO3或10mmol/LNaHSO3直至达到饱和,每次加入不同浓度的Na2SO3或NaHSO3后,

1.3.3 pH干扰实验 采用PBS-CH3CN测试体系,配制pH分别为6.50,6.60,6.70,6.80,6.90,7.00,7.10,7.20,7.30,7.40,7.50,7.60,7.70,7.80,7.90,8.00,8.10和8.20的溶液各3mL.取15μL探针母液加入不同pH值的测试体系中,测定其荧光强度.1.3.4 离子选择性实验 取15μL探针母液,加入3mLPBS-CH3CN的测试体系中,将溶液混合均匀,所得测试体系中探针的浓度为5μmol/L,测定其荧光强度;再分别加入配制好的150μL的各种阳离子和阴离子溶液,再测试其荧光强度.1.3.5 细胞孵育实验 将可传代的HeLa细胞接种在共聚焦皿上,在适宜的培养液中培养(37℃,5%CO2和20%O2)24h后,用PBS缓冲溶液冲洗共聚焦皿3次,移除缓冲溶液,加入培养基培养细培养15min后移除溶液,用PBS缓冲液冲洗3次后,置于荧光共聚焦显微镜下观察细胞的白光和荧光图像

.胞,供后续实验使用.进行细胞成像实验时,将探针加入到共聚焦皿中使探针的浓度为1.0μmol/L,分别测定其紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱.pH=7.4)溶液体系中,将溶液混合均匀,所得测试体系中探针的浓度为5μmol/L.逐渐滴加标准.

2 结果与讨论

2.1 光谱性质Cy5-Br在不同溶剂中的归一化紫外-可见吸收和荧光发射光谱图及数据见图1和表1.可见,Cy5-Br在不同溶剂中的摩尔消光系数较大,说明染料对光的吸收程度好,有利于实际应用.随着溶剂极性的增大,Cy5-Br的紫外吸收和荧光发射波长只有少许红移,荧光量子产率逐渐减小,但总体变化Fig.1 Normalizedabsorbance(A)andemissionspectra(B)ofCy5-Brindifferentsolvents

No.12 -姜 娜等:活细胞线粒体中SO2-3/HSO3的荧光成像2537不大,说明探针分子受溶剂的影响较小.

Table1 SpectraldataofCy5-Brindifferentsolvents

THFSolventλabs/nm655664657648654651645λema/nm668682675668668668663驻λb/nm131818201417182.232.722.472.312.552.410.53εcΦfd(%)12.09.71.410.16.73.77.4DCMDMSOAcetonitrileEthanolWaterMethanol

a.Thedyewasexcitedat610nm;b.StokesshiftofCy5-Br(nm);c.molarextinctioncoefficient(×105mol-1·cm-1·L);d.fluorescencequantumyieldsofCy5-Br.RhodamineBwasusedasastandardreferencewithafluorescencequantumyieldof0.97inethanol,errorswereesti-matedtobe10%forfluorescencequantumyield.

的紫外-可见吸收和荧光发射光谱图.探针Cy5-Br的

665nm,位于近红外光区.2.2 探针性能最大吸收波长及最大荧光发射波长分别为650和图2为探针Cy5-Br在PBS-CH3CN测试体系中

-试体系中,对SO2-3或HSO3的滴定实验.由图3可考察了5μmol/L的Cy5-Br在PBS-CH3CN测

见,探针溶液在650nm处的吸收强度和665nm处

-的荧光强度均随着SO2-3[图3(A)和(B)]或HSO3[图3(C)和(D)]浓度的增加而不断降低.由图4Fig.2 Normalizedabsorbance(a)andemission

spectra(b)ofCy5-BrinPBS-CH3CN

Fig.3 Absorption(A,C)andfluorescencespectra(B,D)ofCy5-Br(5μmol/L)afterincubationwith

differentconcentrationsofsulfite(A,B)andbisulfite(C,D)

PBS-CH3CNsystemat37℃,λex=610nm.c/(μmol·L-1)of(A,B,D):a.16.7;b.33.3;c.50.0;d.66.7;e.83.3;f.100.0;g.116.7;h.133.3;i.150.0;j.166.7;k.183.3;l.200.0;m.216.7;n.233.3;o.250.0;p.266.7;q.283.3;r.300.0;s.316.7;t.333.3;u.350.0.c/(μmol·L-1)of(C):a.0;b.3.3;c.6.7;d.10.0;e.13.3;f.16.7;g.33.3;h.50.0;i.66.7;j.83.3;k.100.0;l.116.7;m.133.3;n.150.0;o.166.7;p.183.3;q.200.0;r.216.7.

2538高等学校化学学报 Vol.35 可见,探针溶液在665nm处的荧光发射强度与SO2-3的浓度在16.6~333.3μmol/L范围内呈良好的线性关系[R=0.9908,图4(A)].而当HSO-3浓度在16.6~266.7μmol/L范围变化时,探针Cy5-Br溶液在665nm处的荧光发射强度同样呈现线性减弱的趋势[R=0.9935,图4(B)].我们推测其检测机理

-与Guo等[3]的报道一致,即SO2-3/HSO3进攻五甲川链上α,β-不饱和结构,继而发生加成反应,破坏染

料的共轭结构,从而表现出染料荧光强度的降低

.

Fig.4 Fluorescenceintensityat665nmofprobeCy5-Br(5μmol/L)afterincubationwithdifferent

concentrationsofsulfite(A)andbisulfite(B)

3-2.3 探针对SO2-3和HSO响应的时间函数

-考察了探针在PBS-CH3CN体系中对SO2-3和HSO3的响应时间,发现5μmol/LCy5-Br在该体系中

-的荧光强度保持在较高的水平.加入500μmol/L的SO2-3(或HSO3)并迅速搅拌后,其荧光强度显著下2-降,约在20s(HSO-3约为30s)后荧光强度趋于稳定(图5).说明该探针在PBS-CH3CN体系中对SO3及HSO-3具有非常快的响应速度.

Fig.5 Time-dependentfluorescencechangesat665nmofCy5-Br(5μmol/L)with500μmol/L

2.4 pH

的影响-SO2-3(A)andHSO3(B)inPBS-CH3CNsystem

由于菁染料本身以大平面共轭的离子形态存

在,故不同的pH值可能对探针的电荷分布产生影

响,实验测试了生理环境pH范围内染料的荧光发

射强度的变化.如图6所示,在生理范围的pH值

下,染料在665nm处的荧光强度变化很小,基本不

受pH的影响.因此Cy5-Br能够在较大的pH范围

2.5 选择性实验-内对SO2-3或者HSO3进行检测.

探针对待测物的选择性是衡量荧光探针性能的

重要指标之一.重点考察了Cy5-Br对于阴离子和

-阳离子的选择性.由图7可见,只有SO2-3或HSO3Fig.6 Fuorescenceintensityat665nmofCy5-Br(5μmol/L)underdifferentpHvaluesλex=610nm.

能猝灭Cy5-Br的部分荧光,而其它各种阴、阳离子均无荧光响应.