水貂肠炎病毒SYBRGreen_荧光定量PCR检测方法的建立_于永乐

水貂肠炎病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测方法

兽类学报，2015，35（1）：102－109ActaTheriologicaSinica

水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光

定量PCＲ检测方法的建立

于永乐张传美

*

杨海燕杨瑞梅张洪亮单虎

*

（青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室，青岛266109）

摘要：根据GenBank登录的水貂肠炎病毒（MEV）VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物，经PCＲ扩增出146bp的目的片段，并克隆到pMD18－T载体上，提取重组质粒经PCＲ及测序鉴定正确后，以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品，绘制荧光定量标准曲线，以此建立一种基于SYBＲGreen荧光染料的定量PCＲ特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明：该方法对MEV有很好的特异性，检测灵敏度为34拷贝/μL，且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中，在80份样品中检测到30份阳性样品，高于普通PCＲ和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析，为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。

关键词：水貂肠炎病毒；SYBＲGreenI；荧光定量PCＲ中图分类号：Q16

文献标识码：A

文章编号：1000－1050（2015）01－0102－08

DevelopmentofaSYBＲGreenIreal-timequantitativePCＲassayforthe

detectionofMinkenteritisvirus

YUYongle，ZHANGChuanmei*，YANGHaiyan，YANGＲuimei，ZHANGHongliang，SHANHu*

（ShandongKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China）

Abstract：AquantitativePCＲassaywasdevelopedforspecificandsensitivedetectionofminkenteritisvirus.Theprimerpairtargetinga146bpfragmentoftheconservedVP2genewasselectedbasedonalignmentofviralsequencesavailableatGenBank.Theanalyticsensibilityofthisassaywas34copiesofplasmidDNA，andithadhighrepeatabilitywithCV＜2%．Theassaywasevaluatedbytesting80fecalsamplescollectedfromsuspiciouscases.Theresultsshowedthat30sam-pleswerefoundpositiveforthevirusinfection，whichwashigherthanthatofroutinePCＲandelectronmicroscopy.There-forethenewassayprovidesausefulmethodfortherapiddiagnosisofminkenteritisandthepreventionandcontrolofthedisease.

Keywords：FluorescencequantitativePCＲ；Minkenteritisvirus；SYBＲGreenI

水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎细小病毒（Minkenteritisvirus，MEV）引起的一种腹泻、血便等肠炎症状的烈性传染病，与水貂犬瘟热、阿留申病并称为水貂养殖业三大疫病（高云等，1984）。Schofield（1949）首次发现本病，Wills（1952）分离鉴定了病原，并命名为水貂肠炎病毒。姜廷秀等（1981）首先报道了我国发生水貂细小病毒性肠炎。目前，MEV引起的水貂病毒性肠炎仍广泛流行，严重阻碍毛皮动物养殖业的健康

发展，特别是给水貂养殖业带来巨大的经济损失（闫喜军等，2008）。

MEV属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parovirus），它是目前动物病毒中形态最小、结构最简单的单链线状病毒之一（Parrish，1994）。该病毒对外界环境变化具有极高的耐受性，在粪便中可存活数年之久，易造成貂场的持续感染。目前针对MEV的鉴定和检测已经有许多方法，如电镜观察、血凝及血凝抑制试验、荧光抗体染色技术、

基金项目：科技基础性工作专项：畜禽重要疫病流行病学调查（2012FY111000）；公益性行业（农业）科研专项：宠物疫病快速诊断

与疫苗研究与示范（201303042）；山东省农业重大应用技术创新项目：水貂犬瘟热、细小病毒防制技术研究

作者简介：于永乐（1988－），男，硕士研究生，主要从事动物传染病防治与生物制品学研究.收稿日期：2014－06－11；

修回日期：2014－12－04

*通讯作者，Correspondingauthors，E-mail：zhangchuanmei100@http://wendang.chazidian.com；shanhu67@http://wendang.chazidian.com

水貂肠炎病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测方法

1期于永乐等：水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光定量PCＲ检测方法的建立103

酶联免疫吸附试验、LAMP试验以及PCＲ技术等（王建科等，2008；庄金秋等，2011；Wangetal.，2013），但是这些检测方法所需时间长、操作繁琐、不能进行定量分析且灵敏性不高。荧光定量技术具有特异性强、灵敏度高、省时省力等优点，已经成为当前病毒核酸快速高效检测的主要方法（李安等，2009）。本研究以MEVVP2基因为靶基因，所建立的SYBＲGreenI荧光定量PCＲ方法可用于MEV的快速诊断与监测。

化DH5α感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，质粒提取试剂盒（天根，中国）进行质粒提取，并将经PCＲ鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。用紫外分光光度计（Eppendorf，德国）测定质粒浓度并计算拷贝数，并根据得到的结果将质粒稀释成1×10－2－1×10－10浓度梯度作为标准样品以备制作标准曲线。1.6

SYBＲGreenI荧光定量PCＲ反应体系和条件

Ｒ

反应体系为20μL，10μLLightCycler○480SYBＲGreenIMaster（Ｒoche，德国），上、下游引

1

1.1

研究方法

病毒、细胞及临床样品

MEV毒株、犬瘟热病毒（CDV3）、阿留申病

毒（ADV）、犬腺病毒（CAV）、E.coliDH5α感受态细胞均由青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室保存。

80份来自山东各地毛皮动物养殖场送检的疑似水貂病毒性肠炎病料，采病变严重的水貂的肠道粪便进行检测。

1.2病毒DNA的提取

按照DNAisoＲegent（Takara，中国大连）说明书提取病毒DNA。1.3

引物设计与合成

根据GenBank上发表的MEV基因组VP2基因序列，选择保守区设计一对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游：5’－ATGCT

，下游：5’－CTTTAGTTGTGGGGAGTTTGGT－3’

GTGGCTGAGTAG－3’，扩增片段长度为146bp。1.4

常规PCＲ扩增

采用25μL反应体系，10×PCＲBuffer2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，rTaq（5U/μL）0.5μL（Takara，中国大连），MEVDNA2μL，灭菌ddH2O补足25μL。PCＲ反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s共35个循环；72℃终延伸10min。应用S1000TMThermalCyclerPCＲ仪（BIO－ＲAD，美国）进行目的基因的扩增。反应结束后，取5μLPCＲ产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。1.5质粒标准品构建

将PCＲ产物进行胶回收和纯化，回收片段与pMD18－T载体（Takara，中国大连）连接，并转

物（10μmol/L）各0.4μL，不同稀释倍数的DNA标准模板1μL，灭菌ddH2O补足体系。阴性对照组中模板改用1μL灭菌ddH2O。反应条件：95℃预变性10min；95℃5s，60℃20s，72℃10s，45个循环。熔解曲线分析条件为：95℃10s，

Ｒ

65℃30s，95℃continue。应用LightCycler○480荧光定量PCＲ仪（Ｒoche，德国）进行荧光定量PCＲ反应。

1.7标准曲线的绘制

－3

将制备的质粒进行10倍倍比稀释，按10、10－4、10－5、10－6、10－75个浓度梯度作标准品，进行实时荧光定量PCＲ反应生成标准曲线。

1.8

特异性试验

提取CDV、CAV和ADV病毒的DNA（其中CDV为提取病毒ＲNA后经反转录为cDNA），按照优化的条件进行荧光定量PCＲ，检测该方法的特异性。

1.9敏感性试验

将制备的标准样品10倍倍比稀释后，选取10－2－10－109个梯度进行荧光定量PCＲ检测，测定该方法的敏感性。同时取倍比稀释的质粒作常规PCＲ，比较两者的敏感度。1.10

重复性试验

将重组质粒标准品按10倍系列稀释，选择高、中、低浓度的质粒样本，每个稀释度一次进行3个重复，将结果进行统计分析确定其可重复性。1.11临床样品检测

采取临床送检的80份病料用常规PCＲ和SYBＲGreenI荧光定量PCＲ方法进行检测。

2

2.1

结果

PCＲ扩增及质粒拷贝数测定

水貂肠炎病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测方法

104

兽类学报35卷

利用1.3设计的引物进行PCＲ扩增，获得了146bp的特异性条带（图1）。将目的基因的产物纯化回收后，亚克隆到pMD18－T载体，构建了重组质粒，将其测序结果与GenBank中MEVVP2基因的相应片段进行比较，结果证实该扩增产物与MEVVP2基因的相应区域的同源性为100%。提取

11

质粒，测定质粒浓度为3.4×10拷贝/μL。

2.2SYBＲGreenI荧光定量扩增后的熔解曲线分

析

通过熔解曲线分析，以验证产物的特异性。本试验的熔解曲线是单一峰，Tm值为76.8℃（图2），表明引物的特异性很好

。

Fig.1

图1PCＲ扩增目的条带

PCＲamplificationoftarget

gene

图2Fig.2

荧光定量PCＲ熔解曲线MeltingcurveofFQ-PCＲ

2.3

标准曲线的绘制

－3－4－5－6－7

选择10、10、10、10、105个浓度能够扩增出S型曲线，其他病毒均不扩增，阴性对照未见扩增（图5）。2.5

敏感性试验

荧光定量反应后，发现在10

－10

梯度作为模板，进行实时荧光定量PCＲ扩增，生成动力学曲线（图3）和标准曲线（图4）。标准曲线斜率为－3.581，轴截距为38.338，线性方程为Y=－3.581X+38.338，相关系数为0.9981，表明线性很好。2.4

特异性试验

将CDV、CAV和ADV病毒的cDNA或DNA作

倍稀释时（图

6），即最低浓度为34拷贝/μL时标准品质粒仍有S型荧光扩增曲线，同时取倍比稀释的质粒进行常规PCＲ检测，结果只能检测出10

－8

倍稀释的质粒

模板（图7），即所建立的MEV定量PCＲ检测方法的检测敏感程度是常规PCＲ检测灵敏度的100倍。

为模板进行荧光定量PCＲ反应，结果发现除MEV

水貂肠炎病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测方法

1期于永乐等：水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光定量PCＲ

检测方法的建立105

图3Fig.3

荧光定量扩增动力学曲线.从左至右依次为1：3.4×108拷贝/μL；2：3.4×107拷贝/μL；3：3.4×106拷贝/μL；DynamiccurvesofFQ-PCＲ.Amplificationcurvesofthestandardsfromlefttoright：1：3.4×108copies/μL；2：3.4×

4：3.4×105拷贝/μL；5：3.4×104拷贝/μL

107copies/μL；3：3.4×106copies/μL；4：3.4×105copies/μL；5：3.4×104copies/μ

L

图4Fig.4

荧光定量PCＲ的标准曲线StandardcurveofFQ-PCＲ

2.6重复性试验选取10

－3

、10－5、10－73个浓度梯度作为模板

方法检测结果都为阳性的有15份，都为阴性的50份，有3份电镜观察阴性而普通PCＲ和荧光定量PCＲ检测阳性，12份电镜观察和普通PCＲ检测阴性而荧光定量PCＲ检测阳性（表2）。荧光定量PCＲ检测结果与电镜观察和普通PCＲ的检测结果符合率达100%，而且还能检测出电镜负染和普通PCＲ不能检测出的阳性样品。荧光定量PCＲ比常规PCＲ的检出率高出15个百分点，表明荧光定量PCＲ更加敏感。

进行荧光定量PCＲ扩增，重复3次，结果显示，每个样本重复性都很好（图8）。统计分析表明，此检测方法重复性较好，3次重复的变异系数（CV）均小于2%（表1）。2.7

临床样品检测

对送检的80份病料分别用电镜观察、常规PCＲ和荧光定量PCＲ进行检测。结果表明，3种

水貂肠炎病毒SYBRGreen荧光定量PCR检测方法

106

表1Table1

样品Sample3.4×1083.4×1063.4×104

3次重复性试验的Ct值

Ct17.2814.2120.84

兽类学报35卷

样品的重复性检测结果

DetectionrepeatabilityofFQ-PCＲ

珋x

Ctvalueofthreerepeatabilitytests

S

CV（%）

Ct27.3014.4721.32

Ct37.4114.4921.42

7.3414.3921.19

0.070.150.31

0.951.081.46

表2

Table2

电镜Electronmicroscopy

阳性病例Positivecase阳性率Positiverate

1518.75%

3种检测方法比较结果

Comparisonofthreedetectionmethods

常规PCＲＲoutinePCＲ

1822.50%

timequantitativePCＲ荧光定量PCＲＲeal-3037.

50%

图5Fig.5

荧光定量PCＲ特异性检测.1－3：MEV毒株扩增曲线；4－6：ADV、CDV、CAV扩增曲线；7：阴性对照

DetectionspecificityofFQ-PCＲ.1－3：AmplificationcurvesofMEVstrains；4－6：AmplificationcurvesofADV，CDVand

CAV；7：negativecontrol

3讨论

细小病毒属的成员，其基因序列一致性高达98%

以上，具有紧密的亲缘关系，但CPV和MEV宿主特异性等方面不同（杨莘等，2011），临床检测上不能将其混为一谈。此外，LAMP方法已被建立且应用于MEV临床检测，该方法操作简单，成本较低，无需昂贵的仪器设备，但引物设计十分复杂，扩增产物的特异性验证比较麻烦。基于此，为了提高MEV检测的特异性和灵敏性，我们建立了专门用于水貂肠炎病毒检测的荧光定量PCＲ方法。

目前报道大多为犬细小病毒的检测方法，如刘海防等（2010）采用TaqMan探针法检测CPV，最低可检测10拷贝/μL模板；李英俊等（2010）

2

建立了荧光定量PCＲ方法可以检测到10个拷贝；康洪涛等（2013）建立了肉食兽类细小病毒TaqMan-MGB荧光定量PCＲ方法，最低可检测35拷贝/μL模板。虽然CPV和MEV同属于细小病毒科