草乌对DNA损伤水平的高效液相色谱测定研究

第30卷第7期2011年7月分析测试学报FENXICESHIXUEBAO（JournalofInstrumentalAnalysis）Vol.30No.7755～759

櫏櫏殽櫏櫏櫏櫏櫏櫏殽

中药草乌为毛茛科植物北乌头（AconitumkusnezoffiiReichb）的干燥块根，有大毒，具有祛风除湿、

［1］［2－4］温经止痛等功效。现代研究表明草乌具有良好的镇痛、抗炎、抗肿瘤等作用，但因其毒性较大，

［5－6］［7］临床应用受到很大限制。目前文献中广泛报道的草乌的毒性主要是心脏毒性和中枢神经毒性，

［8－9］。曹向宇等［8］应用鼠伤寒沙门菌体外回复突变试验（Ames）和彗星实而有关其遗传毒性的报道极少

验（Cometassay）对生草乌及清蒸草乌的遗传毒性进行了研究，发现生草乌具有一定的遗传毒性，而清

［9］蒸草乌无遗传毒性。王亚其等通过小鼠微核实验、Ames实验、染色体畸变实验研究了川乌、草乌、盐附子的遗传毒性，认为草乌在实验条件下无遗传毒性。Ames实验简便、快速，广泛应用于中药诱变性和抗诱变性的研究，但含有大量组氨酸的中草药会导致Ames实验呈假阳性；而检测DNA氧化损伤收稿日期：2011－02－14；修回日期：2011－02－28

基金项目：广西自然科学资金资助项目（0640038）；肇庆市科技计划资助项目（10560）；肇庆学院自然科学基金资助项目（0737）*通讯作者：韦寿莲，硕士，教授，研究方向：药物分析，Tel：0758－2716357，E－mail：weishlmary@http://wendang.chazidian.com櫏櫏櫏櫏櫏櫏殽摘毒性。研究简报草乌对DNA损伤水平的高效液相色谱测定研究*韦寿莲，严子军，刘要：采用高效液相色谱－紫外检测法（HPLC－UV）研究了草乌对脱氧核糖核酸分子（DNA）的损伤效应。C18柱（4.6mm×150mm，5μm），检测波长260nm，流动相为50mmol/LKH2PO4/色谱条件：AgilentTC-K2HPO4缓冲液（pH5.5）－甲醇（9∶1），流速0.8mL/min。8-OHdG）的浓度在1.78～353羟基脱氧鸟苷（8-μmol/L范围内呈良好线性，相关系数为0.9999，检出限（S/N=3）为0.35μmol/L，平均回收率为102%。OHdG的分析，结果表明：长期服用草乌提取将方法用于灌服草乌提取液5周的家兔血清及尿样中排放的8-OHdG的平均排放水平分别为32.9、24.3μmol/L，表明草乌具有潜在的遗传液的家兔，其血清及尿样中8-OHdG）；遗传毒性关键词：草乌；DNA损伤；8-羟基脱氧鸟苷（8-中图分类号：O657.72；TQ460.72文献标识码：A文章编号：1004－4957（2011）07－0755－05doi：10.3969/j.issn.1004－4957.2011.07.008StudyonDeterminationoftheLevelsofDNADamageInducedbyAconitumUsingHighPerformanceLiquidChromatographyWEIShou-lian*，YANZi-jun，LIULing，ZHAOJian-fen（FacultyofChemistryandChemicalEngineering，ZhaoQingUniversity，Zhaoqing526061，China）Abstract：EffectsofDNAdamageinducedbyaconitumwerestudiedbyhighperformanceliquidchromatographywithultravioletdetection（HPLC－UV）．Theworkingconditionswereasfollows：column：AgilentTC-C18（4.6mm×150mm，5μm）；detectionwavelength：260nm；mobilephase：50mmol/LKH2PO4/K2HPO4buffer（pH5.5）－methanol（9∶1）；flowrate：0.8mL/min．Undertheoptimalconditions，thecalibrationcurvewaslinearintheconcentrationrangeof1.78－353μmol/Lfor8-hydorxy-2'-deoxyanosine（8-OHdG），withacorrelationcoefficientof0.9999．Thedetectionlimit（S/N=3）was0.35μmol/L．Themeanrecoverywas102%．Themethodwassuccessfullyappliedtoanalyzethelevelsof8-OHdGinthebloodandurineofrabbitexposedtoaconi-tumbymouthinjectionforfiveconsecutiveweeks．TheresultsshowedthataconitumcancausetheoxidativeDNAdamageandtheformationof8-OHdGafteralong-termadministrationofrabbit，whichindicatedthataconitumcontainsthepotentialgenotoxicity．Keywords：aconitum；DNAdamage；8-hydorxy-2'-deoxyanosine（8-OHdG）；genotoxicity櫏櫏殽玲，赵建芬肇庆526061）（肇庆学院化学化工学院，广东

756分析测试学报第30卷

的彗星实验存在实验步骤多、分析时间长、定量准确性和灵敏度不够高、不易普及等缺陷。随着遗传

OHdG）已成为研究药物遗毒性研究的不断发展，检测DNA氧化损伤的主要标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-

［10］传毒性不可缺少的一部分。

32OHdG的检测方法主要有酶联免疫吸附（ELISA）法［11］、P后标记法［12］、气相色谱法目前8-

（GC）［13］、共振光散射法［14］、毛细管电泳法（CE）［15－16］、高效液相色谱－电化学检测法（HPLC－ECD）［17－18］以及高效液相色谱－紫外检测法（HPLC－UV）［19－21］。上述方法各有优劣，如ELISA法具有

32良好的灵敏度和重复性，但存在交叉反应易导致检测结果偏高；P后标记法灵敏度高、样品用量少、

应用范围广，但易造成放射性污染。而HPLC法具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快等优点，对

OHdG均可检测，是目前应用广泛、较为成熟的方法。组织细胞DNA及尿中8-

OHdG的检测可以评估体内氧化损伤和修复的程度、氧化应激与DNA损伤的相互关由于通过8-

系，因此对研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物与氧化应激的关系等具有重要意义。而国内有关草乌遗传毒性的研究主要集中在体外致突变实验，关于草乌对体外DNA氧化损伤或体内长期服用草乌对机体的损伤研究很少，因此有必要对草乌的遗传毒性进行深入研究。

OHdG作为DNA氧化损伤的生物学标志物，采用HPLC－UV法分析长期服用草乌提取液本文以8-

OHdG水平，以评价草乌的遗传毒性，为草乌临床应用提供科学依据。的家兔血清、尿液中的8-

1

1.1实验部分仪器与试剂

1200型高效液相色谱仪（Agilent，USA），PXS-450型精密离子计（上海大普仪器有限公司），超声

B型水浴恒温振荡器（江苏金坛市亿通电子有限公波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），SHA-

司），微型回流制备仪器（安徽省池州市科析仪器设备有限公司），低速离心机（江苏金坛市亿通电子有限公司）。

OHdG标准品（Sigma公司，草乌（湖北金贵中药饮片有限公司，生产批号080901）；8-

http://wendang.chazidian.comA）；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、柠檬酸、冰醋酸、氢氧化钠、醋酸钠、95%乙醇均为国产分析纯；实验用水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；甲醇（一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）。

1.2色谱条件

AgilentTC-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；紫外检测波长为260nm；流动相组成为50mmol/LKH2PO4/K2HPO4溶液（pH5.5）－甲醇（体积比9∶1），使用前超声脱气；柱温：室温；流速为0.8mL/min；进样量20μL。

1.3

1.3.1样品溶液的制备2］草乌提取液草乌提取液的制备参照文献［方法并加以改进：将100g草乌粉碎成细粉，过40目筛，45℃干燥6h，备用。称取45g草乌粉末，加入200mL95%乙醇，振荡后静置24h，超声提取30min，过滤。药渣中加入200mL95%乙醇超声提取30min，过滤。合并滤液，70℃减压蒸馏至干，用50mL水溶解，制成浓度为0.9g生药/mL草乌提取液。

1.3.2家兔灌喂草乌提取液体内染毒DNA损伤实验新西兰家兔8只，均为雄性，体重（1.70±0.20）kg，由广东中医药实验动物中心提供。

家兔随机分为染毒组和对照组各4只。染毒组每只每天灌喂草乌提取液1mL/次（时间为12∶15PM），连续给药5周，每周给药6d，然后停药1d。对照组给予等体积的生理盐水。末次给药后30min，经耳静脉采血，经膀胱取尿。血浆经离心后取出血清，于－20℃冰箱保存。采集的尿样，于－20℃冰箱保存。

1.3.3样品处理将兔血清和兔尿解冻，3000r·min－1离心30min，除去其中的沉淀物。取上清液进行二次离心，所得滤液过0.2μm滤膜，进样分析。

第7期韦寿莲等：草乌对DNA损伤水平的高效液相色谱测定研究757

2

2.1结果与讨论色谱条件的确定

22］采用文献［的流动相组成：含0.03mmol/L柠檬酸、0.02mmol/L冰醋酸、0.05mmol/L醋酸

OHdG的分离。结钠、0.05mmol/L氢氧化钠的缓冲液（pH6.8）与甲醇以3∶1的体积比混合，用于8-

OHdG未能获得良好分离；而采用文献［23］果发现染毒组兔血清样品中的8-的流动相组成：50mmol/L

KH2PO4/K2HPO4（pH5.5）缓冲液与甲醇以体积比9∶1混合，染毒组兔血清样品及兔尿样品中的8-OHdG均能获得良好分离。因此，实验选择体积比为9∶1的50mmol/LKH2PO4/K2HPO4（pH5.5）－甲

OHdG标准溶液和染毒组兔血清样品的HPLC色谱图，图中的8-醇为流动相。图1为优化实验条件下8-

OHdG色谱峰经加标回收确认。由于各待测样品的基体、pH值及黏度不同，8-OHdG的保留时间略有差异

。

Fig.1OHdG标准溶液（A）和兔血清样品（B）的HPLC色谱图图18-HPLCchromatogramsof8-OHdGstandard（A）andrabbitserumsample（B）

2.2方法的标准曲线与检出限

OHdG标准储备液稀释成6个不同的浓度，在优化色谱条件下进行分离分析，将353μmol/L的8-

OHdG的浓度x（μmol/L）对相应的峰面积y进行线性回归。结果表明，峰面积与浓度在1.78～353以8-

μmol/L范围内具有良好的线性关系，线性方程为y=15.177x+9.3656（r=0.9999），检出限（LOD，S/N=3）为0.35μmol/L。

2.3方法的精密度与准确度

OHdG标准溶液重复进样6次，测得8-OHdG保留时间的平均在优化条件下，将35.3μmol/L的8-

值为15.369min，峰面积的平均值为560.2，对应的相对标准偏差（RSD）分别为0.36%和0.53%。8-OHdG的平均浓度为36.5μmol/L，RSD为0.53%，平均回收率为102%。表明该方法的精密度好，准确度高。

2.4OHdG的分析家兔血和尿中8-

1.3.3”方法处理后进行HPLC测定，结果分别见图1B和图2。其中图1B为染兔血、尿样品按“

毒组兔血清样品的HPLC图，图2A为染毒组兔尿样品稀释10倍后的HPLC图，图2B为染毒组兔尿样品加标稀释10倍后的HPLC图。经加标后，图2B在13.770min处的色谱峰峰高增加且峰形不变，说

OHdG。由于各待测样品的基体、pH值及黏度不同，8-OHdG的明图2A中13.732min处的色谱峰为8-

保留时间略有差异。表1为其加标回收结果，所有数据以平均值±标准偏差（SD）表示，采用t检验比

OHdG的平均浓度为32.9μmol/L，兔尿样中8-较组间差异显著性。结果表明，染毒组兔血清中8-

OHdG的平均浓度为24.3μmol/L。8-OHdG为体内DNA氧化损伤的敏感生物指标，是氧化代谢终产

OHdG可在hOGG1酶的作用下从DNA物，只能通过DNA氧化损伤途径产生。机体修复机制正常时，8-

OHdG则可入血经尿液排出体外链上切除并重新掺入正常的鸟嘌呤碱基，而切下的8-

OHdG含量高于兔尿样。取血时间在草乌提取液作用峰值，因此兔血清中的8-［24］。因实验家兔

DNA氧化损伤可被各种因素诱导，包括内源性细胞代谢产物、化学物、药物、吸烟、电离和非电

OHdG含量较高（分别为32.9、24.3μmol/L），离辐射等。长期服用草乌提取液的家兔，其血、尿中的8-

在统计学上均显著高于正常对照组，组间差异显著（p＜0.001），说明在此条件下草乌提取液能显著诱导

758

分析测试学报第30卷

DNA氧化损伤，产生8-OHdG，有明显的遗传毒性。尿中8-OHdG的水平不受饮食影响，含量稳定，尿中8-OHdG的排出量反映了“全身”DNA受氧化损伤后经切除修复而排出的产物量，若测定值增高，则

［25］

8］提示有DNA氧化损伤增加与修复能力下降的共同表现。而文献［对生草乌遗传毒性的研究也表明

生草乌可引起小鼠股骨骨髓细胞DNA的明显损伤，提示生草乌具有潜在的遗传毒性

。

Fig.2

图2稀释10倍兔尿样的色谱图

HPLCchromatogramsofa10-dilutedrabbiturineafteramonthadministrationofaconitumextractionsolution

A．urinesample；B．urinespikedwith3.53μmol/L8-OHdG

Table1

Sample

OHdG的浓度与加标回收率（n=6）表1兔血清、尿中8-Concentrationsandspikedrecoveriesof8-OHdGinrabbit'sserumandurinesamples（n=6）

Found±SDc/（μmol·L－1）

－*－32.9±0.324.3±0.5

Addedc/（μmol·L－1）

35.335.335.335.3

Average±SDc/（μmol·L－1）

34.8±1.135.0±1.366.7±0.958.7±1.0

RecoveryR/%

99999697

SerumofnormalrabbitUrineofnormalrabbitSerumofinfectedrabbitUrineofinfectedrabbit*nodetected

3结论

OHdG含量的HPLC－UV方法，结果显示，该方法的样本文建立了一种测定家兔血清、尿液中8-品前处理方法简单，且具有广泛的适应性、稳定性和准确性。应用该方法对草乌的遗传毒性进行了研OHdG含量显著高于对照组，表明草乌提取液究，发现长期服用草乌提取液的家兔，其血、尿中的8-能显著增加体内DNA的氧化损伤程度，提示在此条件下草乌有明显的遗传毒性。

参考文献：［1］

［2］

S］．3部．北京：化学工业出版社，2005：51．国家药典委员会．中华人民共和国药典［

．中国药科大学学肖凯，李宏霞，王亚其，王莉，彭成，郭立，刘玉清．乌头类中药的胚胎毒性及致畸性［J］

报，2005，36（6）：567－571．

［3］郭晓庄．有毒中草药大辞典［M］．天津：天津科技翻译出版社，1991．［4］王本祥．新编中药学辞典［M］．天津：天津科技出版社，1996：822．［5］王衍堂，李宏霞，张建军，王金勇，王莉．乌头碱对乳鼠心肌细胞的毒性作用［J］．华西药学杂志，2007，22

（1）：4－6．

［6］王金勇，王亚其，张建军，王衍堂，李宏霞，李颐，肖凯．乌头类中药对CHL细胞的DNA损伤作用［J］．现代

预防医学，2007，34（7）：1204－1206．

［7］何晓娟，王莉，王冲，严光焰，李宏霞．生草乌对小鼠精神神经系统的毒性作用研究［J］．现代预防医学，

2007，34（7）：1218－1220．

［8］曹向宇，杨雷，宋尧，李辉，高鹭，宋有涛．生草乌及清蒸草乌遗传毒性检测分析［J］．中国公共卫生，2009，

25（7）：831－832．

［9］王亚其．乌头类中药遗传毒性研究［D］．成都：四川大学，2006．［10］WULL，CHIOUCC，CHANGPY，WUJT．Urinary8-OHdG：amarkerofoxidativestresstoDNAandariskfactor

forcancer，atherosclerosisanddiabetics［J］．ClinChimActa，2004，339（1/2）：1－9．

［11］CHIOUCC，CHANGPY，CHANEC，WUTL，TSAOKC，WUJT．Urinary8-hydroxydeoxyguanosineanditsana-logsasDNAmarkerofoxidativestress：developmentofanELISAandmeasurementinbothbladderandprostatecancers

［J］．ClinChimActa，2003，334（1/2）：87－94．

第7期韦寿莲等：草乌对DNA损伤水平的高效液相色谱测定研究759

［12］PODMOREK，FARMERPB，HERBERTKE，JONESGDD，MARTINEA．32P-Postlabellingapproachesforthede-

J］．MutatRes，1997，378（1/2）：139－149．tectionof8-oxo-2'-deoxyguanosine-3'-monophosphateinDNA［

［13］MEISR，XUGW，XINGJ，WUCY．Methodfortheanalysisof8-hydroxy-2'-deoxyguanosineinurinebygaschroma-

tography［J］．AnalSci，2001，17（6）：779－781．

［14］DANIELSENPH，MLLERP，JENSENKA，SHARMAAK，WALLINH，BOSSIR，AUTRUPH，MLHAVEL，

RAVANATJL，BRIEDJJ，KOKTMDE，LOFTS．Oxidativestress，DNAdamage，andinflammationinducedbyambientairandwoodsmokeparticulatematterinhumanA549andTHP-1celllines［J］．ChemResToxicol，2011，24

（2）：168－184．

［15］MAYF，LIUGS，DUM，STAYTONI．Recentdevelopmentsinthedeterminationofurinarycancerbiomarkersbycap-

J］．Electrophoresis，2004，25（10/11）：1473－1484．illaryelectrophoresis［

［16］MEISR，YAOQH，CAILS，XINGJ，XUGW，WUCY．Capillaryelectrophoresiswithend-columnamperometric

detectionofurinary8-hydroxy-2'-deoxyguanosine［J］．Electrophoresis，2003，24（9）：1411－1415．

［17］KOIDES，KINOSHITAY，ITON，KIMURAJ，YOKOYAMAK，KARUBEI．Determinationofhumanserum8-hy-

droxy-2'-deoxyguanosine（8-OHdG）byHPLC－ECDcombinedwithsolidphaseextraction（SPE）［J］．JChromatogr：B，2010，878（23）：2163－2167．

［18］NAGASHIMAM，TSUDAH，TAKENOSHITAS，NAGAMACHIY，HIROHASHIS，YOKOTAJ，KASAIH．8-

HydroxydeoxyguanosinelevelsinDNAofhumanbreastcancersarenotsignificantlydifferentfromthoseofnon-cancerousbreasttissuesbytheHPLC－ECDmethod［J］．CancerLett，1995，90（2）：157－162．

［19］HUC，KITTSDD．Antioxidant，prooxidant，andcytotoxicactivitiesofsolvent-fractionateddandelion（taraxacumoffici-

nale）flowerextractsinvitro［J］．JAgricFoodChem，2003，51（1）：301－310．

［20］TSOUTC，LAIHJ，YANGJL．Effectsofmannitolorcatalaseonthegenerationofreactiveoxygenspeciesleadingto

J］．ChemResToxicol，1999，12（10）：1002－1009．DNAdamagebychromium（Ⅵ）reductionwithascorbate［

［21］ZHANGSW，XINGJ，CAILS，WUCY．Molecularlyimprintedmonolithin-tubesolid-phasemicroextractioncoupled

withHPLC/UVdetectionfordeterminationof8-hydroxy-2'-deoxyguanosineinurine［J］．AnalBioanalChem，2009，395

（2）：479－487．

［22］袭著革，晁福寰，孙咏梅，杨丹凤，张华山．高效液相色谱－电化学检测法测定脱氧核糖核酸分子氧化损伤标

J］．分析化学，2001，29（7）：765－767．志物8-羟基脱氧鸟苷［

［23］何天稀，王立光，周丹，赖容，侯经国，高锦章．HPLC－UV检测病人胃粘膜活检组织中8-J］．羟基脱氧鸟苷［

分析试验室，2007，26（11）：67－69．

［24］BOITEUXS，RADICELLAJP．ThehumanOGG1genestructure，functionsanditsimplicationintheprocessofcarcino-

genesis［J］．ArchBiochemBiophys，2000，377（1）：1－8．

［25］SAKANON，WANGDH，TAKAHASHIN，WANGB，SAURIASARIR，KANBARAS，SATOY，TAKIGAWAT，

TAKAKIJ，OGINOK．OxidativestressbiomarkersandlifestylesinJapanesehealthypeople［J］．JClinBiochemNutr，2009，44（2）：185－195．