蓝染色阳性细胞率。锥虫蓝染色细胞为死亡细胞，锥虫蓝拒染的细胞为活的心肌细胞，计算心肌细胞活性。

心肌细胞活性=锥虫蓝拒染的细胞数量/全部检测细胞的数量

×100%

用锥虫蓝染色，死亡细胞因细胞膜完整性破坏，被锥虫蓝染成蓝色，而活性细胞染色呈阴性。经多次实验后发现，急性分离心肌细胞的存活率为60%~80%。

3 讨论

目前文献报道最多的分离心肌细胞的方法是Langendorff逆行主动脉灌流酶溶液消化的方法，而欲获得稳定数量和较高质量的心肌细胞是一件比较困难的事情[14-15]。用Langendorff装置分离心肌细胞的方法技术已经很成熟，方法步骤大同小异，而分离出细胞的质量取决于个人在分离过程中对各个因素，如实验步骤，酶溶液，酶消化时间，细胞保存，试剂配制等各细节的调节和掌控。提高分离细胞的存活率和细胞对钙的耐受性是心肌细胞急性分离追求的目标。

“钙反常”现象是心肌细胞急性分离的难点之一。“钙反常”即当在无钙溶液中分离的心肌细胞再次进入生理浓度的钙溶液中时，细胞会补停的收缩，逐渐变圆，迅速失去原有的结构和收缩功能，直到最后溶解死亡。“钙反常”的准确机制尚不完全清楚[16]。多数学者认为心肌细胞发生“钙反常”的机制是由于大量钙离子短暂快速进入细胞内，钠离子外流，导致细胞内钙负载有关。据报道心肌细胞的活性状态是直接导致“钙反常”的根本原因，实验的每一步都可能影响到心肌细胞的状 态[17-18] 。

过去急性分离细胞的灌流过程可大致分为4个步骤：①正常钙浓度溶液。②无钙溶液。③酶溶液。④低钙溶液或保护液。有报道心肌细胞分离第1步使用正常钙浓度溶液灌流[19]，以达到通过心脏收缩排出冠状动脉内残余血，防止心脏阻塞影响灌流消化的目的。而早年Witenberg等发现在分离液中若将游离钙浓度稍增加，分离的细胞就很少存活下来[20]。实验权衡了细胞分离出的存活率和钙耐受性，综合考虑，认为步骤①可省去。因为其会使消耗的时间加长，且钙的存在使心脏的持续的搏动，增加了心脏的能量代谢，很容易使氨基酸和蛋白质丢失，使心脏发白，导致分离出的细胞数量减少，且很不耐钙。所以实验直接用无钙台式液灌流，不仅减

主要观察指标：①心肌细胞形态学。②细胞存活率。③心肌细胞的钙耐受性。

统计学分析：实验数据由第一作者采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 2.1 心肌细胞形态学观察 经急性分离可分离出单个的心肌细胞，存活率达60%~80%，细胞为长杆状或矩形，横纹清晰，菱角分明，立体感强，折光性好，膜表面干净，个别杆状细胞可见有节律的舒缩活动，其余为静息状态，见图1。也有少量横纹模糊，内有小泡，挛缩成圆形或椭圆形的死细胞，不能做为实验标本用。

Figure 1 Myocardial cells of adult Sprague-Dawley rats(×400)

图1 急性分离的成年SD大鼠心肌细胞 (×400)

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复钙后，有3/5左右的心肌细胞维持杆状，其中约10%的心肌细胞发生自发收缩，其余的呈静息状态，为钙耐受性细胞。放4 ℃保存，细胞可存活36 h。细胞的数量足够用于实验研究。

2.2 心肌细胞活力检测 见表1。

少了细胞能量消耗，还能保证细胞的无钙环境，为进一步酶解创造更好的前提。 分离心肌细胞时酶消化的终止时间很重要，消化酶

的浓度过高及消化时间过长都可造成细胞膜不可修复的损害[21]。有报道认为当心脏颜色变黄，表现较松弛时终止酶消化较合适[22]。高浓度的酶对细胞造成很大的损

伤，会破坏细胞膜的结构，使细胞活性降低。本实验，

酶溶液中酶浓度为0.2 g/L，牛血清白蛋白浓度为 0.25 g/L。降低的酶浓度能在不明显延长消化时间的前

ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

提下防止消化过度。在酶液中加入BSA可保护已经分离

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韦丽兰，等. 成年大鼠心肌细胞的急性分离方法

出的心肌细胞膜，使其免于酶的进一步消化，从而提高了分离细胞的存活率，使细胞活性更好，提高耐钙细胞的比例。

最后用50 mL含500 µL的2.0 mL CaCl2的低钙溶液终止消化，不仅可以冲洗心脏和冠脉内残存的消化酶，以免进一步消化，还可使在酶消化结束后逐步增加细胞外液中钙的浓度，从而降低了“钙反常”的发生概率。

细胞的保存方法也很重要。实验让细胞两次自然降沉，后用KB液重悬，两次的降沉除去了坏死了的细胞及细胞瓦解释放的因子，如溶酶体等对细胞有损害的因素，因此，细胞能存活更久，活性更好，更耐钙。

影响细胞分离的因素很多，其中每个步骤都是可以调节和控制的，在分离时每一细节都要谨慎认真。如所选的动物要健康，悬挂心脏速度要快，各液体的pH严格测量，且使用前都要O2饱和，灌流全程防止气泡生成，温度的控制及所有实验用器械和实验全程都要尽量保持清洁等。且实验时要根据当时的情况，如心脏大小，外界的温度等，综合分析，调节和控制细胞分离过程中的各影响因素，以保证分离的心肌细胞的数量和质量，为研究提供高活性的细胞。本实验不仅步骤简单，时程短，且所用的酶量很少，节省了很大的经济开销，最重要的是较容易就获得较多的活性细胞和耐钙细胞。

致谢：感谢广西医科大学实验中心提供了所有实验

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设备，实验才得以完成。感谢广西医科大学动物中心提供的实验动物。感谢广西医科大学实验中心的老师在实验中给予的热情帮忙。

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来自本文课题的更多信息--

基金声明：广西科学基金项目(0728140)，课题名称：

红景天苷影响大鼠心肌细胞工作的机制的研究。

作者贡献：第一作者进行实验设计，进行和实施，第一、

二作者进行实验评估，资料收集为第。第一作者成文，第二作者审校，第一、二作者对文章负责。

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利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济

组织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年

《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

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本文创新性：自从1969年Kono首次报道了酶解法被

运用于细胞分离以来，用酶解法分离心肌细胞一直是最主要的方法。所以如何控制好实验中的影响因素以便获得大量具有正常生理功能的心肌细胞，较高的存活率等都是心肌细胞分离中的关键问题。本实验根据实验经验对分离方法进行了改进，主动调节和控制细胞分离过程中的各影响因素，并确定了通过调节和控制细胞分离过程中的各影响因素可以保证分离的心肌细胞的数量和质量。

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