高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品

?论

高特异性ＰＣＲ方法鉴别乌梢蛇及其混淆品

著?

唐晓晶１，冯成强１，黄璐琦ｈ，钱忠直２，崔光红１，张继３（１．中国中医科学院中药研究所，北京１００７００；２．国家药典委员会，北京

１０００６１；３．中国药品生物制品检定所，北京１０００５０）

摘要：目的建立一种简便、准确的鸟梢蛇药材ＤＮＡ分子标记鉴别方法。方法根据鸟梢蛇及１０种常见混淆品线粒体１２ＳｒＲＮＡ基因序列，设计一对专用于鸟梢蛇的鉴别引物ＨＷＬ—ｌ和ＨＷＨ一１，用不同的复性温度ＰＣＲ扩增，确立特异性反应条件，并利用此方法鉴别从市场上购买的各种鸟梢蛇药材。结果ＰＣＲ结果是在６５℃复性温度下，正品鸟梢蛇得到约３２０ｂｏ的扩增带，而混淆品在同样的条件下无扩增带。为检验该方法的准确性，对市售鸟梢蛇炮制品随机选取１３块进行ＰＣＲ鉴别验证，其中正品９块，混淆品４块，检出率达１００％。结论所设计的鉴别引物对正品乌梢蛇有高度的特异性。ＰＣＲ方法稳定性高，同种不同个体间的种内差异对鉴定结果无影响。本方法简单、准确、快速、灵敏度高、重现性好。关键词：鸟梢蛇；高特异性；ＰＣＲ鉴别中图分类号：Ｒ２８４

文献标识码：Ａ

文章编号：１００１—２４９４（２００７）０５—０３３３—０４

ＨｉｇｈＳｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＺａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓａｎｄＩｔｓＡｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ

ＴＡＮＧ

Ｘｉａｏ－ｊｉｎ９１，ＦＥＮＧ

Ｃｈｅｎｇ—ｑｉａｎ９１，ＨＵＡＮＧ

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Ｚｈｏｎｇ—ｚｈｉ２，ＣＵＩ

Ｇｕａｎｇ—ｈｏｎ９１，ＺＨＡＮＧＪｉ３

（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｌｔｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆ

Ｃｈｉｎａ

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ｍａｃｏｐｅｉａ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００６０１，Ｃｈｉｎａ；３．ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒ

ｔｈｅＣｏｎｔｒｏｌ

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ｐｒｉｍｅｒ（ＨＷＬ－ｌ

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ＨＷＨ－１）ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｆｏｒｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇＺａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｏｆｓｎａｋｅ．Ａ

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ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｅｍｐｌｏｙｅｄａｍｐｌｉｆｙｔｈｅＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＺａｏｃｙｓｄｈｕｍ－

ａｎｄ１０ｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｏｆｓｎａｋｅ，ｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．Ｕｓｉｎｇｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ，Ｚａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓｆｒｏｍｔｈｉｒｔｅｅｎｓａｍ—

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Ａｂｏｕｔ３２０ｂｐＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔ

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ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍＺａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓｉｎＰＣＲ

ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

６５℃．ｗｈｅｒｅａｓ

ａｎｙ

ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔＷａｓ

ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｎａｋｅｓａｍｐｌｅｓｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｒｅａｃｔｉｏｎ

ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｚａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｉｒｔｅｅｎ

ＷａｓｃｌｅａｒｌｙｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄｆｒｏｍｏｔｈｅｒｂｙＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓ．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔ

ｓａｍｐｌｅｓ。ｂｏｕｇｈｔｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｒｕｇｓｔｏｒｅｓ，ｗｅｒｅａｌｓｏｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｗｉｔｈｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓ．髓ｅｒｅｓｕｌｔｓ

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Ｚａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｓ

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ｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｌｕｓｉｏｎｏｆａｕｔｈｅｎｔｉｅａ－

ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ

ｄｅｓｉｇｎｅｄ

ａｒｅｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＺａｏｃｙｓｄｈｕｍｎｎｄｅｓ．７１１ｌｉｓ

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ｉｓｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ

ａｎｄ

ｒｅｐｒｏｄｕｃａｂｌｅ．

ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ＺａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａＺｋｓ；ｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃ；ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

乌梢蛇为《中国药典》（２００５版）一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇［Ｚａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓ（Ｃａｎｔｏｒ）］的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮…。

鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状旧Ｊ，我们对市

场上乌梢蛇药材流通情况进行了调查。商品流通中多以红点锦蛇［Ｅｌａｐｈｅｒｕｆｏｄｏｒｓａｔａ（Ｃａｎｔｏｒ）］、黑眉锦蛇［Ｅｌａｐｈｅｔａｅｎｉｕｒａ（Ｃｏｐｅ）］、玉斑锦蛇［Ｅ／ａｐｈｅ，ｍｎ－ｄａｒｉｎｕｓ（Ｃａｎｔｏｒ）］、王锦蛇［觑０ｐ船ｃａｒｉｎａｔａ（Ｇｕｅｎｔｈ—ｅｒ）］、灰鼠蛇［Ｐｔｙａｓｋｏｒｒｏｓ（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）］等来混作正品药材进行销售【３】，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加

作者简介：唐晓晶，女，硕士

２６３．ｎｅｔ

‘通讯作者：黄璐琦，男．研究员Ｔｅｌ：（０１０）６４０１４４１１－２９５５Ｆａｘ：（ｏｒｅ）８４０４４３４０Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｕｑｉ＠

中国药学杂志２００７年３月第４２卷第５期

ＣｈｉｎＰｈａｒｒｎ．，，２００７Ｍａｒｃｈ，Ｖ０１．４２Ｎｏ．５

?３３３?

工处理时剖去内脏后，要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。随着分子生物技术的发展，利用

药材分子遗传标记鉴别研究，满足目前市场常见混

伪品的鉴别要求，寻找更为经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，本实验用高特异性ＰＣＲ方法对乌梢

蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。１材料与方法１．１材料

用于高特异性ＰＣＲ鉴别方法学研究的实验材料见表１。乌梢蛇炮制品购自北京同仁堂、北京京隆堂、北京阳光同仁药房、北京金象大药房。１．２乌梢蛇高特异性ＰＣＲ鉴别引物的设计

ＤＮＡ分子遗传标记技术鉴别中药材的真伪已成为

可能。王义权等Ｈｏ通过对乌梢蛇及其混淆品线粒体Ｃｙｔｂ基因进行测序，通过对测序结果的比对分析来鉴别乌梢蛇的真伪，但因对ＤＮＡ进行测序成本较高，操作有难度，不同人的测序结果会存在偏差，所以在实际应用中适用性不强。为了深入乌梢蛇类

表１实验材料的种类、来源和数量

Ｔａｂ１

Ｎｕｍｂｅｒａｎｄ

Ｃｏｄｅ１、２３４

ＺａｏｃｙｓＺａｏｅｙｓＺａｏｃｙｓ

ｓｏｕｒｃｅ

ｏｆｓｐｅｃｉｅｓｏｆｃｒｕｄｅｄｒｕｇｓｕｓｅｄｆｏｒＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

Ｓｐｅｃｉｅｓ

Ｓ㈣ｅ

Ｚｈａｎｇｓｈｕ，ｊｉａｎｇｘｉＡＩＩ斟Ｏ，ＨｅｂｅｉＣｈａｎｇｂｅｉ，ｊｉａ，喾ｄＺｈａｎｇｓｈｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ

＾ｔＸｌｇＵＯ，ＨｅｂｅｉＡｎｇｕｏ。Ｈｅｂｅｉ

Ｎｕｍｂｅｒ

２ｌ１２ｌ１ｌｌｌｌｌ２２３２２２２ｌｌ２ｌｌ

ｄｈｕｍｎａｄｅｓ（Ｃａｎｔｏｒ）ｄｈｕｍｎａｄｅｓ（Ｃａｎｔｏｒ）ｄｈｕｍｎａｄｅｓ（Ｃａｎｌｏｒ）

５觑叩ｋｒｕｆｏｄｏｒｓａｔａ（Ｃａｎｔｏｒ）

６７

Ｅ／ａｐｈｅ

ｒｕｆｏｄｏｒｓａｔａ（Ｃａｎｔｏｒ）

Ｅ／ａｐｈｅ肌凸眦如［几ｈｍ（Ｃａｎｔｏｒ）

８矾印ｋｍａｎｄａ而ｍｓ（Ｃａｎｔｏｒ）Ｚｌｍｎｇｓｈｕ，Ｊｉ∞ｇｘｉ

Ａｎｇｕｏ，ＨｅｂｅｉＮＩＣＰＢＰｌ）

Ｚｈａｎｇ＊ｈｕ，ＪｉａｒｌｇｘｉＮＩＣＰＢＰｌ）

Ｚｌｍｎｇｓｈｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ

９尉啦ｅ

１０１１１２

蛐ｔａｄ／ａｍ（Ｓｅｈｌｅｇｅｌ）

ｔ＇ｔｙａｓ／Ⅻｒｏｓ（Ｓｃｌｄｅｇｅｌ）

Ｐｔｙａｓ

ｒａｄ／ｕｔａ（Ｓ＆ｈｓｄ）

ｋｏｒｒｏｓ（Ｓｎｈｈｇｅｌ）

１３剧印ｋ缸ｅ耐ｍ（Ｃｏｐｅ）

１４

Ｅｌａｐｌｗ

ｔｏ”ｎｉｕｒａ（Ｃｏｐｅ）ｃｈａＩｌｇｂｅｉ。ＪｉａｎｇｘｉＺｈａｎｇｓｈｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ

Ａｎｇｕｏ，ｌｔｅｂｅｉ

１５、觑啦ｅｃａｒｉｎａｔａ（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ）１６。觑啦ｅｃａｒ／ｎａｔａ（Ｇｕｅｎ＆ｅｒ）

１７１８１９２０２１

Ｄｉｎｏｄｏｎ

ｎ讲ⅫＤ，棚（Ｃａｎｔｏｒ）

Ｚｈａｎｇｓｈｕ，Ｊｈｎ祭ｉ

Ａｎｇｕｏ，Ｈｅｂｅｉ

Ｄ／ｎｏｔｉｏｎ九讲格明拼姗（Ｃａｎｔｏｒ）

Ｎａｔｒ／ｘ

ａｎｎｕ／ａｍ（Ｈａｌｌｏｗｄｌ）Ｚｈａｎｇｓｈｕ，Ｊｉａｎｇｘｌ

Ｎａｔｒ缸伽眦‘砷（Ｈａｌｌｏｗｅｌｌ）Ａ“印ｏ，Ｈｅｂｅｉ蜘ｎａｊａ（Ｌｉ＝ｎｕｅｕｓ）Ｚｈａｎｇｓｈｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ

ＮＩＣＰＢＰｌ）Ａｎｇｕｏ，Ｈｅｂｅｉ

ＰｔｙａｓＰｔｙａｓ

２２Ⅳｃ咖Ｍ豇（Ｌｉｎｎｕｅｕｓ）

２３２４

ｍｉｔｒｅｓｌｌ８（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）ｍｕｃｏＭｌ＊（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）

ＺｌｍｎｇＢｈｕ，Ｊｉａｎ商

注：１）中国药品生物制品检定所

Ｎｏｍ：１）ｍ出∞ｍｉｎｓｔｉｔｕｔｅ

ｆｏｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｗｄｕｃｌａ

从ＧｅｎＢａｎｋ下载正品原动物乌梢蛇及混伪品黑眉锦蛇、红点锦蛇、灰鼠蛇、眼镜蛇、赤链蛇、玉斑锦蛇、赤链华游蛇、王锦蛇、滑鼠蛇、原动物线粒体

１２Ｓ

蛇段）的干燥肌肉组织约１ｇ，参照王义权等［５３方法提取ＤＮＡ模板。

１．４特异性ＰＣＲ鉴别方法

ｒＲＮＡ基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号依次为：

ＡＦ２３３９４０，

ＡＦ２３６６７５，ＡＦ２３６６７０，

ＡＦ２３６６８０，

ＰＣＲ反应体系２５斗Ｌ，其中１０ｍｍｏｌ?Ｌ一７蹦ｓ．

ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍｍｏｌ?Ｌ。１氯化钾，Ｍ９２＋１．５ｍｍｏｌ?Ｌ～，ｄＮｌｌＰ各０．１５斗ｍｏｌ?Ｌ～，Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ

ＤＮＡ５０

Ｅｘ

１

Ｕ

ＡＦ２３６６７６，ＡＦ２３６６８３，

Ａ砣３３９３９，Ａ砣３６６７７，

ＡＦ２３６６７４，ＡＹｌ２２８２８），经ＤＮＡＭＡＮ软件对位排列分析正、混品间ＤＮＡ序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇１２ＳｒＲＮＡ基因片段的特异性鉴别引物ＨＷＬ－１和ＨＷＨ－１（上海生工生物公司合成）。乌梢蛇及其混淆品１２ＳｒＲＮＡ序列（约８００ｂｐ）的部分序列，见表２。

１．３模板ＤＮＡ的提取

取乌梢蛇及混淆品原动物和炮制品（醋炙乌梢

ＣｈｉｎＰｈａｎｎ．，，２００７Ｍａｒｃｈ，Ｖ０１．４２Ｎｏ．５

Ｔａｑ），引物各Ｏ．１５ｐ。ｍｏｌ?Ｌ～，模板

ｃｃ延伸３０ｓ；２５个

ｎｇ。循环参数：９５℃预变性４ｒａｉｎ；９５℃变

ｍｉｎ，７２

性４０ｓ，５５—６５℃复性ｌ

循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ反应选用不同的复性温度以寻找合适的ＰＣＲ鉴别反应参数。实验中设

置无ＤＮＡ模板的阴性对照。取５灿反应液经

１．８％琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色，紫外凝胶分析检测，成像。

中国药学杂志２００７年３月第４２卷第５期

表２乌梢蛇及其混淆品１２５ｒＲＮＡ序列（约８００ｂｐ）的部分序列

Ｔａｂ２

Ｐａｒｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ１２５ｒＲＮＡｏｆＺａｏｃｙｓｄｈｕｍｎａｄｅｓａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ

注：斜体加粗部分为设计的特异性引物

Ｎｏｔｅ：Ｉｔａｌｉｃｐ８ｒ１８ａ∞ｄ档ｉｓｎｏｄ印ｅｃ击ｏｐｒｉｍｅ

同时用扩增约４００ｂｐ的１２ＳｒＲＮＡ基因片段的通用引物（Ｌ１０９１

５

７

扩增出一条带（图２Ｂ）；当复性温度升至６５℃，２５个循环时，其反应具有高度特异性，仅正品乌梢蛇有良好的单一扩增带，其余样品皆无扩增带出现。当退火和延伸温度合并为６８℃时，正品也未见扩增带出现。故特异性ＰＣＲ循环参数确定为：９５℃预变性４ｍｉｎ；９５℃变性４０Ｓ，６５℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸３０ｓ，２５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ。因此，依据鉴

ＡＡＡｃ７ｒＧＧＧＡｌＴＡＧＡ７ｒＡＣ?５

７

ＣＣＣＡＣＴＡＴ３’和Ｈ１４７８

７Ｉ＇ＧＡｃＴＧｃＡＧＡＧＧＧＴ一

ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴ３’）在５５℃的复性温度下对上述用于ＰＣＲ鉴别的模板ＤＮＡ作阳性扩增对照【６Ｊ。２结果

２．１模板质量研究

乌梢蛇药材及混淆品原动物和炮制品（醋炙乌梢蛇段）提取的ＤＮＡ模板用通用引物Ｌ１０９１和Ｈ１４７８扩增，得到约４００ｂｐ扩增带（图１），表明样品中模板ＤＮＡ质量符合ＰＣＲ反应的要求。

别引物扩增模板ＤＮＡ有无扩增条带即可确定受试

样品是否为正品（图３）。

图２退火温度５５（Ａ）和６０ｏＣ（Ｂ）乌梢蛇鉴别引物ＰＣＲ扩增

图１

１２Ｓ

ｒＲＮＡ基因通用引物Ｌ１０９１（Ａ）和Ｈ１４７８（Ｂ）扩增

Ｆｉｇ２

Ａｇａｒｏｓｅ

ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅ

ａｔ

模板ＤＮＡ（阳性对照）

Ｆｉｇ１

ＡｇａｒｏｓｅｇｅｌｄｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ１２Ｓ

ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｒｕｄｅｓｎａｋｅｄｒｕｇｓ；Ａ—ＡｎｎｅａｌｅｄＢ—Ａｎｎｅａｌｅｄａｔ６０ｏＣ．Ｃｏｄｅｓｂｌｅｌ

ａｒｅ

５５ｏＣ；

ｔｈｅ翻ｌｌ，ｎｅ嬲ｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＴａ－

ｒＲＮＡｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｆｒｏｍｏｒｉｇｉｎａｌｎｅａｌｅｄ

ａｔ

ａｎｉｍａｌｓ［Ｐｏｓｉｔｉｖｅ

ｃｏｎｔｒｏｌ

ａｌｌ—

５５℃ｗｉｔｈｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒｓＬ１０９１（Ａ）ａｎｄＨ１４７８２．３个体差异的研究

因物种种内存在变异，本次实验针对动物类药材不同产地间物种的变异是否会影响ＰＣＲ特异性鉴别结果进行了验证。将所有收集到的乌梢蛇正品及混淆品原动物的ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ鉴别，结果显示不同来源的４个正品乌梢蛇在３２０ｂｐ处出现扩增带，而混淆品均未见扩增带（图３Ｂ）。表明乌梢

Ｃｈｉｎ

Ｐｈａｒｍ

（Ｂ）］

２．２

高特异性ＰＣＲ鉴别的研究

用鉴别引物ＰＣＲ扩增乌梢蛇原动物样品的

ＤＮＡ，当复性温度为５５℃时，乌梢蛇的正品有两条

带，玉斑锦蛇、红点锦蛇、三索锦蛇有１条很弱的带

（图２Ａ）；当复性温度为６０℃，乌梢蛇、赤链蛇同时

中国药学杂志２００７年３月第４２卷第５期

Ｊ，２００７Ｍａｒｃｈ，Ｖ０１．４２

Ｎｏ．５

图３退火温度６５℃鸟梢蛇鉴别引物ＰＣＲ扩增

Ｆｉｇ３

Ａｇａｒｏｓ

ｇｅｌｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｎｅａｌｅｄａｔ

６５℃ｗｉｔｈ

ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ

ｐｆｉｍｅ碍ＨＷＬ－１

ａｎｄＨＷＨ－１．

Ｎ——Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ—－ＤＮＡｓｉｚｅｍａｒｋｅｒ

蛇及其混淆品同一物种的种内差异不会影响高特异

性ＰＣＲ鉴别的结果。

２．４炮制品特异性鉴别的研究

用乌梢蛇鉴别引物，对北京同仁堂、京隆堂、阳光同仁药房、金象大药房随机购买的乌梢蛇药材炮制品进行ＰＣＲ鉴别，结果显示，样品１，２，３，４，６，８，１１，１２，１３在约３２０ｂｐ处出现一条明亮的扩增带，表明为正品乌梢蛇；而样品５，７，９，１０均无扩增带出现，表明是乌梢蛇的混淆品（图４）。本结果与根据药材外观性状、显微鉴别的鉴定结果完全一致。

图４

６５℃时鸟梢蛇炮制品ＰＣＲ鉴别反应；Ｎ一阴性对照；Ｍ—ＤＮＡ

ｍａｒｋｅｒ；１—４一北京同仁堂；５—７一北京京隆堂；

８—１０二｛Ｖ．京阳光同仁大药房；１１一１３一北京金象药房

Ｆｉｇ４

ＡｇａｒｏｓｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ

ｆｏｒｉｄｅｎｔｉ－

ｆｉｅａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｒｔｅｅｎｓａｍｐｌｅｆｒｏｍｄｒｕｇｓｔｏｒｓ

ｌ一４一ＢｅｉｊｉｎｇＴｂｎｇ

ｒｅｎ

ｔａｎｇ；５～７一ＢｅｒｉｎｇＪｉｎｇｌｏｎｇｔａｎｇ；８一

１０一Ｂｅｉｊｉｎｇ

Ｙａｎｇｇｕａｎｇｔｏｎｇｒｅｎｙａｏｆａｎｇ；１

１～１３一ＢｅｉｊｉｎｇＪｉｎｘ－

ｉａｎｇｙａｏｆａｎｇ；Ｎ—?ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｏｕｔＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅ；Ｍ—－ＤＮＡｍａｒｋｅｒ

３讨论３．１市场调查

文献报道的乌梢蛇混淆品达二三十种，不同文献报道的种类也存在较大差异，本次研究未能包括所有文献报道的混淆品。实际调查中发现，有些混淆品在商品流通中出现的频率极低，另一些则由于来源于非游蛇科，在外观上其形态、大小与乌梢蛇相

ＣｈｉｎＰｈａｒｍＪ，２００７Ｍａｒｃｈ，Ｖ０１．４２Ｎｏ．５　

差很远，通过性状特征容易区别开。所以本课题组寻找市场上充伪频率高、来源相近、外观形态上与乌梢蛇相近的品种，进行了ＰＣＲ鉴别研究，这才具有重要意义。

３．２

药材炮制品的特异性鉴别

市售的乌梢蛇药材部分是经过醋炙的乌梢蛇

段，失去个体的完整性，更利于不法商贩进行制假、掺假，以大量的混淆品来充当正品乌梢蛇。由于药

材在醋炙过程中外观形态、皮和骨骼等会发生不同程度的改变，所以给乌梢蛇药材性状鉴别带来了更大的困难。而本研究显示，用ＤＮＡ分子标记鉴别则

能够更好地克服这个弊端，对乌梢蛇类药材的炮制

品在ＤＮＡ水平上进行准确鉴定。如将这对特异性引物加入Ｔａｑ试剂盒配成鉴别试剂盒，ＰＣＲ时只需加入模板和引物，反应完成后即可直接电泳，使鉴别反应更加简化、便捷；供各级药检所用来鉴定药材及其炮制品，具有很大的应用价值。真正体现出了药材分子鉴别快速、准确可靠、易于操作的优点。３．３个体差异的研究

动物类药材由于其自身的特殊性，与植物药不同的是它不会固定生长。蛇类药材的产地遍布于全国，是否不同产地、人工繁殖或野生乌梢蛇种内差异

会影响到ＰＣＲ鉴别的结果，为此在收集样品时，分

别从不同地方收集到同一种的不同个体，正品乌梢蛇药材达到４条，炮制品购自不同药店１３件，有效避免了每个物种只有一个样品的弊端，从而消除了

出现假阳性的可能。

致谢：江西省药品检验所章光文所长、中药室罗耀华主任、周国平主任在实验样品的收集过程中给予帮助。

ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ

［１］

饥．Ｐ

２００５Ｖｏｌ

Ｉ（中国药典２００５年版一部）［ｓ】．２００５：５３．

［２］ＸＩＡＯ

Ｐ

Ｇ．ＭｏｄｅｍＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａｌ

Ｍｅｄ＆ａ（新编中药志）［Ｍ］．

Ｖｏｌ

ＩＶ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ

Ｐｒｅｓｓ，２００１：２４６－２４９．

［３］

ＷＡＮＧ

Ｙ

Ｑ，ＺＨＯＵ

Ｋ

Ｙ．Ｃｏｍｍｅｗｉａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ

ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉ—

ｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｓｎａｋｅｄｒＩＩ挚［Ｊ］．仍讥ＭｅｄＭａｔ（中药材），１９９６，１９

（６）：２８５－２９０．

［４３

ＷＡＮＧ

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ｓｔｉｔｕｔｅｓＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ

Ｐｈａｒｍ

Ｓｉｎ（药学学

报），１９９９，３４（１）：６７－７１．

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ＷＡＮＧＹ

Ｑ，ＺＨＯＵ

ＫＹ．Ａ

ｐｍｈｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙ

ｏｎ

ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ－

ｔｉｏｎ

ｏｆ

ｃｒｕｄｅｓｎａｋｅｄｒｕｇｓｂｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ

Ｐｈａｒｍ

Ｓ／ｎ（药学学报）。１９９７，３２（５）：３８４－３８７．

Ｅ６３

ＷＡＮＧＹ

Ｑ，ＺＨＯＵＫＹ，ＸＵＬｓ，ｅｔ以ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆＣｙｔｂｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ“Ｊｉｎｑｉａｎｂａｉｈｕａｓｈｅ”

（Ｂｕｎｇａｒｕｓｐａｒｖｕｓ）ａｎｄｉｔｓａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ［Ｊ］．ＡｅｔａＰｈａｒｍＳ／ｎ（药学学报），１９９８，３３（１２）：９４１－９４７．

（收稿日期：２００５．１０－２４）

中国药学杂志２００７年３月第４２卷第５期