生物工程

园艺植物中的抗性基因及其应用

摘要：干旱、盐害、重金属毒害、病虫害等逆境灾害都会严重影响植物的正常生长发育,所以通过研究植物的抗性基因提高其抗逆性是十分重要的. 植物抗性基因的克隆和功能鉴定研究,为提高植物的抗逆性奠定了理论基础.现阶段植物细胞的基因转移主要有农杆菌介导和病毒载体介导两种形式.目前已有十几种植物的外源抗性基因应用于转基因植物研究中. 关键词：园艺植物 抗性基因 应用

20 世纪80年代以来植物基因工程技术发展迅猛,这就为植物抗性育种研究开辟了新的途径,并形成了以园艺植物抗性基因研究为重点的对相关基因的定位、克隆、序列分析,抗性相关蛋白结构分类及外源基因的整合与表达等一系列新的研究热点.

1.植物的抗性基因

植物抗性基因可分为两大类: 第一类是功能基因, 这些基因编码的蛋白质对逆境中的植物直接起保护作用; 第二类是调节基因, 它们编码的蛋白质是在信号传导途径和对逆境基因表达起调节作用中起调控作用的因子[1].

1.1功能基因

功能基因主要包括渗透调节基因、清除活性氧的酶基因及保护生物大分子的活性基因等.像海藻糖合成基因、脯氨酸合成基因、甘露醇合成基因、甜菜碱合成酶基因、果聚糖合成基因、肌醇甲酯合成基因、多胺合成基因,这些都是与渗透调节有关的基因,如Cape ll等发现的Adc在水稻中的超量表达就缓解了干旱条件下转基因水稻叶绿素的损失, 并提高了抗旱性;而清除活性氧的酶基因能提高清除氧自由基的能力, 保护和稳定蛋白复合体及膜结构,也可以提高植物抗性,Gupta等发现过量表达Cu /Zn- SOD的转基因烟草在冷和高光胁迫下过氧化物毒害耐性提高[1] ;调渗蛋白(OSM )相关基因、脱水蛋白基因、水通道蛋白( aquapormi , AQP)基因、苹果酸酶、晚期胚胎发生丰富蛋白( LEA)等基因均在保护生物大分子及膜结构中起至关重要的作用,LEA蛋白具有抗旱保护作用、离子结合特性以及抗氧化活性;水孔蛋白存在于

细胞膜和液泡膜上,在细胞乃至整个植物体水分吸收和运输过程中发挥重要作用[4]. 有研究证明, 在干旱诱导型启动子驱动下, 水稻LEA3蛋白基因OsLEA3 - 1 显著提高了抗旱性.

1.2调节基因

与抗旱相关的转录因子有DREB、MYC/MYB、bZIP、WRKY和NAC类，与抗病相关的35S 启动子驱动的几丁质酶chi5B 基因等,与抗重金属有关的水孔蛋白基因TcPIP等.由于转录因子能在转录水平上调控一系列基因的表达, 所以转化调节基因可能可以有效地提高植物的抗逆性.

OsSKIPa SKIP( Ski- in terac ting prote in)能积极调整细胞生存能力和水稻的抗逆性.转基因水稻中OsSKIPa 的表达极大地提高了在逆境(脱落酸、盐以及甘露醇)中的生长能力以及苗期和生殖生长阶段的抗旱能力, 增加清除活性氧的能力和提高干旱胁迫下与逆境相关基因的转录水平; DREB转录因子与抗逆基因启动子区域中的DRE 顺式作用元件(如拟南芥的rd10 、rd17 以及rd29A等结合, 参与干旱、高盐等胁迫应答反应, 增强植物的抗逆性[2] ;几丁质酶chi5B 基因转入烟草、油菜、水稻,在植物体内均能高效表达, 抗病性明显[3] ;重金属抑制根系对水分的吸收和运输,在重金属富集植物遏蓝菜中克隆了2个水孔蛋白基因TcPIP,在重金属胁迫下可能具有增强水分运输的作用[4].

2.植物细胞的基因转移

2.1农杆菌介导的基因转移

植物伤口释放出如乙酰丁香酮（AS）以及羟基乙酰丁香酮（OHAS）等的信号分子;VirA以及VirG基因在酚类物质的诱导下得到表达;VirD1和VirD2蛋白表达与T－DNA边界重复序列结合解缠绕与切割,VirC1和VirC2参与下,形成T－DNA转移中间体,并以DNA－蛋白质复合体形式存在和转移,VirE1和VirE2参与该过程;T－链蛋白复合体（T－链、VirD2、VirE2）在VirB基因表达产物作用下,穿越细胞膜,VirB操纵子具有11个基因,产物定位于细胞膜上并形成一种膜结合T－复合体运输器,其中VirD2和VirE2蛋白分别具有导航和核定位作用;VirD2、VirE2以及VirF蛋白进入植物细胞;T－链蛋白复合体转移到细胞后,通过核膜上的小孔进入细胞核,与核DNA整合（见图1）.

图1 农杆菌介导的基因转移示意图

2.2病毒载体介导的基因转移

随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入,用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益真到我们的重视,因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中,而且不受单子叶或双子叶的限制,有转染植物细胞原生质体和转染植物组织两种形式.

转染植物原生质体是以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体,去除有关的致病性基因,换上外源基因,体外包装成有有感染力的病毒颗粒,转染植物细胞原生质体,并由此再生成整株植物.

转染植物组织是以植物双生病毒为载体的,植物双生病毒式一单链DNA病毒,成熟的双生病毒呈双颗粒状,每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链.其中A链能单独在植物细胞中复制,并含有一部分病毒包衣蛋白基因;B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因.A、B两条链必须同处于一个植物细胞中,方能形成有感染力的病毒.双生病毒具有广泛的宿主细胞范围,因此是一种很有潜力的植物病毒载体.双生病毒家族成员番茄金花叶病毒（TGMV）在转染植物组织是的克隆表达载体的构建程序（见图2）.

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图2 TGMV克隆表达载体的构建程序

3.植物抗性基因的应用

3.1草坪草的改良

草坪草的改良一直依赖于传统的育种手段,虽然许多性状已得到长足的改进,但改良的局限性也已日益明显. 将转基因技术融合到传统的育种手段中,可以兼顾抗性和草坪草品质两方面, 定向改变草坪草的一些性状,不仅可拓展改良的范围,而且也有助于解决一些常规育种方法难以解决的特殊问题,创造新的草坪草品种. 1988年获得首例转基因草鸭茅, 1992年获得第1个苇状羊茅转基因植株,接着转基因技术在主要的草坪草品种上相继获得成功,如匍匐翦股颖(Agrostis palustris) 、草甸羊茅( Fes2tuca pra tensis) 、紫羊茅( Festuca rubra)等. 近年来,基因枪和农杆菌转化技术日趋成熟,转化的目标已转向抗病虫、抗寒旱、抗盐以及提高草坪的色泽方面,在防止基因漂移方面也进行了初步的尝试,但目前转化的目标基因仅是单基因,尚未见到将含有耐旱寒、抗病虫、抗除草剂等2 个基因同时转化的报道,四季常绿的品种也未见报道. 目前,转基因草坪草尚未进入商业化应用阶段[4].

3.2提高蔬菜产量

培育抗逆境杂交新品种是解决逆境胁迫，提高产量的关键所在.往往一些野生种蔬菜在适应周围环境的过程中,逐步演化出一定的抗逆境性, 成为蔬菜抗逆境遗传改良的宝贵资源.Eshed等就利用S. pennellii LA716 构建了单片段渐渗系, 利用该套渐渗系已对1 000 多

个控制不同类型农艺性状的QT L 进行了定位, 广泛应用于番茄产量、品质、抗病等遗传改 良[5].

在后续植物抗性的研究中,我们应该考虑到:① 选用安全性较高的筛选标记基因;② 盐、干旱这几种胁迫耐受的机制是相互干扰的;③ 植物受到胁迫和从胁迫中恢复的周期是一个普遍的过程,也是与胁迫耐受密切相关的;④ 应观察长期胁迫对植物生长的影响,因为这种长期胁迫才更接近大多数作物的寿命.

转基因植物抗性基因资源还有待进一步发掘,但随着分子生物学技术和方法的不断发展和完善,植物抗性研究的不断深入,在植物体内建立可受逆境胁迫诱导表达的、比较完善的抗逆境体系,将会有更多的抗境转基因作物应用于生产实践,造福于全人类.

参考文献: 1.李晓慧,董明伟,刘康,等.植物抗旱基因及其功能研究进展[J]. 江苏农业科

学,2009,5:73-76.

2.化烨,才华,柏锡,等.植耐盐基因工程研究进展[J].华北农业大学学

报,2010,41(10):150-156.

3.谢晓亮,赵和,温春秀,等. 抗病基因质粒pAHCGG的构建及应用研究[J].华北农

学报, 2003 , 18: 59- 62.

4.张玉秀,徐进,王校,等. 植物抗旱和耐重金属基因工程研究进展[J].农业生态学

报,2007,18 (7) : 1631- 1639.

5.侯喜林,余庆辉,王柏柯,等.番茄芽期耐盐QTL 定位及其效应的初步分析[J].

西北植物学报, 2010, 30( 9) : 1792- 1798.