豆油替代鱼油对中华绒螯蟹幼蟹生长_非特异性免疫和抗病力的影响_陈彦良

中国水产科学 2014年5月, 21(3): 511?521 Journal of Fishery Sciences of China DOI: 10.3724/SP.J.1118.2014.00511

研究论文

豆油替代鱼油对中华绒螯蟹幼蟹生长、非特异性免疫和抗病力的影响

陈彦良, 李二超, 禹娜, 田文静, 江星, 孙立梅, 齐霁, 陈立侨

华东师范大学 生命科学学院, 上海 200062

摘要: 以酪蛋白和明胶为蛋白源配制5组等氮等能的实验饲料, 分别为全鱼油(F1)、25%(F2)、50%(F3)和75%(F4)豆油替代组和全豆油组(F5), 每组4个重复, 投喂初始体质量为(0.27±0.03) g的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹6周, 评价豆油替代鱼油的饲料对幼蟹生长、非特异性免疫力和抗病力的影响。结果发现, 各组幼蟹的存活率差异不显著(P>0.05); F4组幼蟹的增重率和特定生长率显著高于F1组(P<0.05), 但与其他各组差异不显著(P>0.05)。F4组幼蟹的血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均显著高于其他各组(P<0.05), F5组最低。幼蟹的血清中超氧化物歧化酶活性以F4组最高, 显著高于F3组(P<0.05), F3和F4组均显著高于其他各组(P<0.05), 其他F1、F2和F5三组间差异不显著(P>0.05)。F1组幼蟹的血清丙二醛含量最高(P<0.05), 其余各组之间则差异不显著(P>0.05); F4组幼蟹的血清酚氧化酶活性最高, 而F5组最低(P<0.05); 各组幼蟹的溶菌酶差异不显著(P>0.05)。实验结束后, 采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒10 d, 发现F5组幼蟹最早出现死亡, 且该组幼蟹的累积死亡率显著高于F1和F4组(P<0.05)。结果提示, 采用豆油完全替代饲料中的鱼油对幼蟹的生长影响不显著, 但会降低其抵抗感染疾病的能力; 用75%豆油替代鱼油可在明显提高幼蟹免疫机能和抗病力的情况下获得良好的生长性能。 关键词: 中华绒螯蟹;

鱼油; 豆油; 替代; 生长; 非特异性免疫; 幼蟹

中图分类号: S963 文献标志码: A 文章编号: 1005?8737?(2014)03?0511?11

脂类不仅为动物的正常生长提供能量和必需脂肪酸, 同时在机体的免疫上也起到了相应的调节作用[1]。鱼油因富含高不饱和脂肪酸和具有良好的诱食性, 故作为最佳脂肪源在水产养殖生产中被广泛应用。2008年, 世界水产行业消耗了全球鱼油产量的近90%[2], 行业产量达到525万t, 产值约985亿美元[3]。而水产养殖自20世纪80年代开始以每年8%的速度增长, 水产饲料生产对鱼油的需求也不断的增长, 导致鱼油的价格不断攀升[4]。与此同时, 鱼油还存在易氧化和含有害物质二英等不利因素, 而植物脂肪源具有资源

丰富、成本低廉和富含多不饱和脂肪酸等优势, 因此, 筛选合适的植物脂肪源来合理替代鱼油, 是目前饲料工业和水产养殖业一个亟待解决的问题。在众多植物脂肪源中, 豆油因其来源广泛, 质量稳定, 并且能够提供丰富的亚油酸而备受人们关注。随着凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)饲料中豆油替代鱼油的比例升高, 对虾的存活率、肝体比升高, 饵料系数则随之下降, 但是增重率和特定生长率之间并差异不显著, 这表明饲料中豆油部分或全部替代鱼油后, 对凡纳滨对虾的生长性能影响不显著[5]。红螯螯虾(Cherax quadric-

收稿日期: 2013-12-04; 修订日期: 2014-02-20.

基金项目: 国家自然科学基金项目(31172422); 国家973计划项目(2014CB138603); 公益性行业(农业)科研专项(201003020,

201203065); “十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD25B00); 上海市中华绒螯蟹现代农业产业技术体系建设项目; 上海市科委重点项目(10JC1404100); 上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心项目(ZF1206).

作者简介: 陈彦良(1986?), 男, 博士, 主要从事水生动物营养研究. E-mail: cyl19860114@http://wendang.chazidian.com 通信作者: 陈立侨, 教授. E-mail: lqchen@http://wendang.chazidian.com

512 中国水产科学 第21卷

arinatus)饲料中添加鱼油、花生油、豆油和猪油等不同脂肪源, 豆油组的红螯螯虾特定生长率、增重率等生长性能均显著高于其余组, 提示使用富含十八碳饱和脂肪酸的豆油可以替代富含20:5n-3(EPA)、22:6n-3(DHA)的鱼油, 并且对其生长性能影响不显著[6]。日本沼虾(Macrobrachium nipponense)饲料中分别使用牛油、豆油、鱼油和混合油[鱼油︰豆油=2︰1(V/V)]作为脂肪源, 豆油和混合油组日本沼虾的增重率和存活率明显高于其他两组, 饵料系数则明显低于其他组, 说明豆油部分或者完全替代鱼油不仅不会对沼虾的生长性能造成影响, 还可以起到节约成本的作用。

但是随着饲料中豆油添加量的提高, 势必引入更多的亚油酸, 这将改变动物体内n-3/n-6多不饱和脂肪酸的比例, 从而影响机体的免疫代谢和抵抗胁迫能力。不仅如此, 鱼油所提供的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)等n-3高不饱和脂肪酸(HUFA)也有增强机体的免疫性能的作用[9]。添加适量的n-3HUFA对大黄鱼(Larmichthys crocea)的免疫机能和抗病力均有改善作用[10]; 投喂n-3HUFA强化的饲料后, 南美蓝对虾(Penaeus stylirostris)不仅对环境变化的抵抗力增强, 而且其血浆凝集作用和血细胞的呼吸爆发作用均得到了提升

[11]

[8]

[7]

生长和脂肪酸合成酶的影响。但是有关采用植物

脂肪源合理替代鱼油, 以及对机体的生长、免疫机能和抗病力的研究尚未见报道。因此, 本实验以不同比例的豆油替代鱼油, 探讨了不同饲料对中华绒螯蟹幼蟹生长性能、免疫以及抗病力的影响, 以期找到幼蟹饲料中豆油替代鱼油的适宜比例, 为优化中华绒螯蟹的配合饲料提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

以酪蛋白和明胶为蛋白源配制基础饲料, 分别在基础饲料中添加大豆油0、1.5、3、4.5、6 g/(100 g)和鱼油6、4.5、3、1.5、0 g/(100 g), 配制成用大豆油替代0、25%、50%、75%和100%鱼油的5组等氮等能饲料, 各组分别用F1~F5表示, 饲料的配方组成及营养分析如表1所示。原料经粉碎机粉碎后过80目筛, 称重后按逐级放大原则将原料混匀, 然后加适量的水混合均匀, 用绞肉机加工成直径2 mm的颗粒, 保存于?20℃的冰箱中备用。饲料的脂肪酸成分分析见表2。 1.2 实验动物、饲养实验与取样

实验用中华绒螯蟹幼蟹购于上海崇明养殖场, 购进后放在水泥池(10 m×5 m×1.5 m)中暂养1周, 暂养期间用商业饲料进行投喂。实验时选出大小基本一致, 附肢完整, 体质量为(0.27±0.03) g的幼蟹, 随机分为5个组, 每组4个平行, 置于20个容积为300 L的水族箱中饲养, 每箱投放40只蟹。养殖期间, 每天投喂实验饲料2次(9:00 am和16:00 pm), 2 h后吸去粪便和残饵, 每天换水1/3~1/2, 实验期间, 不间断对养殖水体充氧, 溶氧保持在6.42~8.78 mg/L, 水温26.5~31.0℃, 氨氮<0.01 mg/L, pH为8.0±0.4, 养殖周期为42 d。

养殖实验结束后, 对每个水族箱中的幼蟹分别进行计数、称重, 计算各组生长率等相关指标, 计算公式如下:

存活率=[(N0–Nt)/N0]×100% 增重率=[(Wt–W0)/W0]×100% 特定生长率=(lnWt–lnW0)×100/t

饲料系数=WF/(Wt–W0)

。由于虾蟹类缺乏将多不饱和脂肪酸去

饱和和延长碳链转化成高度不饱和脂肪酸的能力, 需从外界摄入多(高)不饱和脂肪酸来满足其自身的需求

[12?13]

。因此, 在研究虾蟹类的脂类需求和

合理搭配时, 既要考虑保证生长性能良好, 同时也要保证动物具有良好的免疫性能和抵抗疾病感染的能力。

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,

是中国特有的淡水名优养殖种类, 因其独特风味和营养价值, 市场需求量逐年增长, 养殖面积和产量迅速提高[15?16]。有关中华绒螯蟹脂肪源的选择和搭配等已有相关报道, 邱仁杰等[17]研究了鱼油、豆油及鱼油豆油混合对中华绒螯蟹免疫和耐低氧性能的影响, 李伟国等[18]选用不同脂肪源, 探讨了饲料中不同脂肪源及添加量对中华绒螯蟹

[14]

第3期 陈彦良等: 豆油替代鱼油对中华绒螯蟹幼蟹生长、非特异性免疫和抗病力的影响 513

表1 饲料配方组成及营养分析

Tab.1 Formulation and proximate analysis of the experimental diets

%

成分ingredient 酪蛋白casein 明胶gelatin 玉米淀粉corn starch 诱食剂a attractanta 复合维生素b vitamin mixb 复合矿物质mineral mix 羧甲基纤维素钠CMC 胆固醇cholesterol 磷脂lecithin

氯化胆碱choline choride 纤维素cellulose 鱼油fish oil 豆油soybean oil 组成成分composition 水分moisture 粗蛋白crude protein 粗脂肪crude lipid 灰分ash

c

c

F1 F2 F3 F4 F5 38 38 38 38 38 10 10 10 10 10 25 25 25 25 25 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1 1 1 1 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 7 7 7 7 7 6 4.5 3 1.5 0 0 1.5 3 4.5 6

9.49 9.64 8.96 9.15 9.26 38.91 40.12 39.27 39.42 40.34 6.49 6.52 6.54 6.45 6.51 4.63 4.67 4.59 4.56 4.57

注: a. 诱食剂(每100 g饲料): 甘氨酸0.6 g, 丙氨酸0.6 g, 谷氨酸0.6 g, 甜菜碱1.2 g.

b. 维生素混合物(每kg混合物): 维生素A, 350 000 IU; 维生素D3, 450 000 IU; 维生素E, 20 g; 维生素K3, 7.5 g; 维生素B1, 10 g; 维生素B2, 10 g; 维生素B6, 12 g; 维生素B12, 20 mg; 烟酰胺, 40 mg; 叶酸, 3 g; 泛酸钙, 30 g; 生物素, 100 mg; 维生素C, 60 g; 肌醇, 60 g.

c. 矿物质混合物(每100 g混合物): 磷酸二氢钠, 10 g; 磷酸二氢钾, 21.5 g; 磷酸钙, 26.5 g; 碳酸钙, 10.5 g; 乳酸钙, 16.5 g; 硫酸镁, 10 g; 氯化铝, 1.2 g; 硫酸锌, 0.511 g; 柠檬酸亚铁, 0.061 g; 硫酸镁, 0.143 g; 碘化钾, 0.058 g; 氯化铜, 0.051 g; 氯化钴, 0.176 g; 氯化钾, 2.8 g. Note: a. Attractant(per 100 g diet): glycine 0.6 g, alanine 0.6 g, glutamate 0.6 g, betaine1.2 g.

b. Vitamin mix(per kg mix): vitamin A, 350 000 IU; vitamin D, 3 450 000 IU; vitamin E, 20 g; menadione, 7.5 g; thiamin, 10 g; riboflavin, 10 g; pyridoxamine, 12 g; cobalamin, 20 mg; nicotinamide, 40 mg; folic acid, 3g; calcium pantothenate, 30 g; biotin, 100 mg; ascorbic acid, 60 g; inositol, 60 g.

c. Mineral mix(per 100 g mix): NaH2PO4, 10 g; KH2PO4, 21.5 g; Ca(H2PO4)2?2H2O, 26.5 g; CaCO3, 10.5 g; Ca-lactate, 16.5 g; MgSO4?7H2O, 10 g; AlCl3?2H2O, 1.2 g; ZnSO4?7H2O, 0.511 g; Fe-citrate, 0.061 g; MnSO4?4H2O, 0.143 g; KI, 0.058 g; CuCl2, 0.051 g; CoCl2?6H2O, 0.176 g; KCl, 2.8 g.

式中, N0为最初养殖的幼蟹数量(只); Nt为养殖过程中死亡个体数(只); Wt为幼蟹终平均体质量(g); W0为幼蟹初平均体质量(g); WF为采用空白溶失校正后的摄食饵料重量(g), t为养殖天数(d)。

称重后, 从每个水族箱中随机选取5只蟹解剖取肝胰腺用于脂肪酸成分测定。剩余的蟹置于冰上麻醉后, 用1 mL不加抗凝剂的注射器采血淋巴, 随机将3只幼蟹的血淋巴置于同一管中, 于4℃冰箱凝结24 h后, 5 000 r/min 离心10 min后分离血清, 于?80℃保存。 1.3 样品脂肪酸测定

采用Folch推荐的方法, 按照氯仿︰甲醇=2︰

1(V/V)的比例萃取饲料及肝胰腺样品中的总脂[19]。通过标准的三氟化硼?乙醚络合法, 将总脂皂化为甲酯形态[20]。脂肪酸甲酯(FAME)的分析采用Agilent 6890气相色谱仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), 该仪器配备了火焰电离检测器及SP-2560熔融石英毛细管(100 m, 0.25 mm i.d.和0.20 µm厚膜)。流入和检测温度分别为270℃和280℃。管温120℃维持5 min后, 按每分钟提高3℃的程序, 升温至240℃, 维持20 min。运载气体为氮气(2 mL/min), 分流比为30︰1。通过将脂肪酸甲酯吸收峰相对保留时间与Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)标准品进行比较, 鉴定脂肪酸组

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表2 饲料脂肪酸组成成分分析

Tab.2 Fatty-acid composition of experimental diets

第21卷

%

脂肪酸 fatty acid

C14:0 C16:0 C18:0 C18:1n9 C20:1n9 C22:1n9 C24:1n9

ΣMUFA C18:2n6 C18:3n6

C20:4n6 Σn-6PUFA C18:3n3 C20:5n3 C22:6n3 Σn-3HUFA Σn-3PUFA n-3/n-6 ratio

F1 F2 F3 F4 F5 5.51 4.31 1.1 1.26 0.36 19.66 17.8 11.49 12.31 11.62 4.45 4.48 3.91 4.23 4.4 23.38 23.43 26.14 24.97 24.79 2.1 1.77 1.58 1.07 0.67 0.29 0.23 1.14 0.098 ? ? 0.21 ?

?

?

25.77 25.64 28.86 26.14 25.46 14.55 22.62 36.28 42.71 50.14 ?

?

? 0.33 0.39

0.61 0.49 0.43 0.21 0.07 15.16 23.11 36.71 43.25 50.6 3.15 3.7 3.67 4.9 5.71 7.14 5.56 3.88 1.89 0.19 7.62 5.94 5.28 2.1 0.19 14.76 11.5 9.16 3.99 0.38 17.91 15.2 12.83 8.89 6.09 1.18 0.66 0.35 0.21 0.12

C15:0 0.51 0.41 ? 0.14 0.05

ΣSAFA 30.13 27 16.5 17.94 16.43

注: 表中数字表示某脂肪酸占总脂肪酸的百分比. ΣSAFA: 饱和脂肪酸; ΣMUFA: 单不饱和脂肪酸; Σn-6PUFA: 18:2n6, 18:3n6 and 20:4n6; Σn-3PUFA: 18:3n3, 20:5n3 and 22:6n3; Σn-3HUFA: 20:5n3 and 22:6n3. “?” 表示未测出.

Note: Figure in the table represents the percentage of the fatty acid in total fatty acids. ΣSAFA: saturated fatty acid; ΣMUFA: monounsatu-rated fatty acid; Σn-6PUFA: 18:2n6, 18:3n6 and 20:4n6; Σn-3PUFA: 18:3n3, 20:5n3 and 22:6n3; Σn-3HUFA: 20:5n3 and 22:6n3. “–” means

undetected.

成结构。脂肪酸含量采用该脂肪酸在总脂中所占百分比进行计算。 1.4 检测指标及测定方法

血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性, 丙二醛(MDA)含量的测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒, 按照使用说明进行操作。

ACP、AKP活性单位定义: 100 cm3血清在37℃条件下与底物作用l5 min, 产生l mg酚为1个金氏单位(U/mg);

SOD活性单位定义: 1 cm3反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个亚硝酸盐单位(U/mL);

丙二醛含量的测定采用TBA法, 基于过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)

缩合, 形成红色产物, 在532 nm处有最大吸收峰。 血清溶菌酶活性的测定参照Hultmark等[21]

的方法进行。将溶壁微球菌冻干粉用0.1 mol/L pH6.4的磷酸钾盐缓冲液配成一定浓度的悬液(OD570 nm≈0.3), 取3 mL该悬液与50 μL待测血清于试管中混匀, 用分光光度计测初始吸光值(A0), 然后置于28℃水浴温育45 min, 取出后立即置于冰浴中10 min终止反应, 测570 nm处吸光值(A)。LYZ活性(U) = (A0?A)/A。

血清酚氧化酶活性的测定根据Gollas的方法略作调整[22], 取50 μL待测样品与50 μL胰蛋白酶溶液(0.1 mg/mL in CAC buffer)放入酶标孔中, 室温下温育10 min, 然后加入50 μL左旋多巴(L-dopa)溶液 (3 mg/mL), 室温下温育10 min后, 立刻放入酶标仪中在492 nm 下测定酶活动力

第3期 陈彦良等: 豆油替代鱼油对中华绒螯蟹幼蟹生长、非特异性免疫和抗病力的影响 515

学。1个酶活力单位定义为: 每分钟每毫克蛋白吸光值变化0.001为1个酶活力单位。 1.5 攻毒实验

冷冻储存的嗜水气单胞菌(Aeromonas hy-drophila)购自上海海洋大学。菌株接种到营养琼脂培养基中, 在生化培养箱中30℃光照培养48 h进行菌株复壮。将复壮的菌种重悬于0.85%的生理盐水中, 悬液浓度控制在1×107 CFU/mL(从预实验中得到的半致死浓度)。

生长实验结束后, 每缸随机挑选15只幼蟹, 注射0.1 mL浓度为1×107 CFU/mL的嗜水气单胞菌, 随后按生长实验的程序继续投喂饲养。每日2次记录死亡情况, 并捞出死蟹, 攻毒实验持续10 d。 1.6 数据分析和统计

实验数据均以平均值±标准误(±SE)表示, 经SPSS17.0分析软件分析单因素方差(One-Way

ANOVA)后, 若存在显著差异(P<0.05), 则采用Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 生长性能

从6周的生长实验结果来看, 实验结束时, F1组幼蟹的存活率最高, 但各组之间差异不显著(P>0.05, 表3)。F1组幼蟹的增重率及特定生长率, 显著低于F4组(P<0.05), 但与F2、F3及F5间差异不显著(P>0.05), F4组较其他各组获得了最大的增重率和特定生长率。随着豆油的添加比例的提高, F2~F5组幼蟹的增重率和特定生长率有先升后降的趋势, 但上述各组间差异不显著(P>0.05)。

从饵料系数上看, F4组最小, 单一添加鱼油和豆油的F1和F5组均高于混合组F2~F3, 但各组间差异不显著(P>0.05)。

表3 饲料中不同比例豆油替代鱼油对幼蟹增重率、特定生长率、饲料系数和存活率的影响

Tab.3 Growth performance of juvenile Eriocheir sinensis fed different diets

n=4;±SE

分组 group

初始体质量/g initial body weight

终末体质量/g final body weight

增重率/% weight gain rate

特定生长率/(%·d–1) specific growth rate

饲料系数feed coefficient

存活率/% survival rate

F1 0.27±0.01 1.36±0.02a 394.67±8.59a 3.82±0.04a 1.61±0.14 69.38±4.49

F2 0.27±0.01 1.40±0.04ab 412.95±12.89ab 3.89±0.06ab 1.54±0.18 62.50±2.70 64.38±3.13 F3 0.27±0.01 1.40±0.04ab 414.90±15.91ab 3.90±0.07ab 1.52±0.14 F4 0.27±0.01

1.54±0.02b 467.65±8.68b 4.13±0.04b 1.45±0.13 64.38±2.13

60.63±2.34 F5 0.27±0.01 1.50±0.09ab 431.82±34.24ab 3.96±0.15ab 1.64±0.14 注: 表中同一列右上角小写字母不同表示差异显著(P<0.05).

Note:Different subscripts in the same line indicate significant difference between groups (P<0.05).

2.2 血清非特异性免疫指标

从表4可见, 投喂不同豆油替代鱼油比例的饲料显著影响了幼蟹血清酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的活性。其中, F4组的幼蟹血清ACP和AKP活性最高, 显著高于其他各组(P<0.05), F3和F2组次之, F5组最低, 并显著低于其他各组(P<0.05)。酚氧化物酶(PO)的活性也在F4组达到峰值, 且显著高于其他各组(P<0.05), 而F5组中幼蟹血清PO活性最低, 显著低于其他4个组(P<0.05)。各组幼蟹血清的溶菌酶(LYZ)活性差异不显著(P>0.05)。

从表4的结果还可见, F4组的超氧化物歧化

酶(SOD)活性是最高的, 显著高于其他各组(P<0.05), 其次是F3组, 其他如F1、F2、F5组间差异不显著(P>0.05)。丙二醛(MDA)的含量在全鱼油F1组是最高的, 显著高于其他4组(P<0.05), F2~F5四组间差异不显著(P>0.05)。 2.3 肝胰腺脂肪酸组成

饲料的脂肪酸组成影响了幼蟹肝胰腺的脂肪酸组成 (表5)。F1、F2和F3组未检测到C12:0, C14:0和 C16:0含量随着豆油替代鱼油比例的提高呈下降趋势, 其中, F1组显著高于其他4组(P<0.05)。C18:0含量在F5组最高, 显著高于其他各组(P<0.05), 其次是F1和F3组, F2和F4组最低。