苹果果实质地软化过程中碳水化合物代谢及其关键酶基因表达的变化

园艺学报，2015，42 (3)：409–417.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0867；http：//www. ahs. ac. cn 409 苹果果实质地软化过程中碳水化合物代谢及其关键酶基因表达的变化

齐秀东1，魏建梅2,*，李永红3

（1河北科技师范学院，河北秦皇岛 066004；2中国环境管理干部学院生态学系，河北秦皇岛 066004；3河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北昌黎 066600）

摘 要：以耐贮的富士苹果和不耐贮的金冠苹果果实为试材，研究果实发育和采后软化过程中糖和

淀粉含量及其代谢相关酶活性变化，并分析其关键酶基因表达的变化。结果表明，淀粉含量和淀粉酶（AM）

活性与果实硬度变化显著相关，且在富士和金冠果实间差异显著。随果实软化，金冠果实AM活性显著

升高，而富士果实维持在较低水平，与金冠果实淀粉含量下降而富士淀粉含量低且稳定的变化规律相吻

合；MdAM基因在金冠贮藏期的表达量迅速增加，显著高于富士。苹果果实蔗糖、果糖和葡萄糖含量均

与成熟期果实硬度变化显著相关，贮藏期金冠果实蔗糖含量与硬度变化显著负相关，且SPS活性与硬度

下降显著负相关，MdSPS基因大量表达，与此期SPS活性升高及蔗糖积累相一致。由此认为，淀粉降解

参与了苹果果实软化，并与果实耐贮性关系密切，而且SPS在苹果果实蔗糖代谢和果实软化中起着重要

作用，也与果实贮藏品质存在一定的相关性。

关键词：苹果；果实；发育；质地软化；糖；淀粉；代谢；基因表达

中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0409-09

Carbohydrate Metabolism and the Key Gene Expression in Apple During Fruit Texture Softening

QI Xiu-dong1，WEI Jian-mei2,*，and LI Yong-hong3

（1Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao，Hebei 066004，China；2Department of Ecology，Environmental Management College of China，Qinhuangdao，Hebei 066004，China；3Changli Fruit Institute，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Changli，Hebei 066600，China）

Abstract：The fruits of‘Fuji’and‘Golden Delicious’apple were taken as materials to investigate the changes of the soluble sugars and starch contents and metabolism-related enzymes activities，and analyzed the expression level of the MdSPS and MdAM genes during fruit development and softening. The results indicated that the changes of starch content and amylase（AM）activity had significant correlation with firmness loss and show significant differences between‘Fuji’and‘Golden Delicious’fruits. AM activity significantly increased in‘Golden Delicious’with fruit softening，while it remained a relatively low activity in‘Fuji’fruit. These phenomena were consistent with the decrease of starch content in‘Golden 收稿日期：2014–10–31；修回日期：2015–01–29

基金项目：河北省科技支撑计划项目（12226806）；河北省博士专项基金项目（2010055006）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xbndwjm@http://wendang.chazidian.com）

致谢：西北农林科技大学园艺学院马锋旺教授给本文提供了相关指导和部分实验条件，特此感谢。

Qi Xiu-dong，Wei Jian-mei，Li Yong-hong.

Carbohydrate metabolism and the key gene expression in apple during fruit texture softening.

410 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：409–417. Delicious’and the low content of starch in‘Fuji’fruit. In addition，the expression level of MdAM gene increased rapidly in‘Golden Delicious’fruit during storage，being compared to that in‘Fuji’fruit. We also found that the changes of sucrose，fructose and glucose content were significantly correlated with the loss of fruit firmness during maturity，which excepted that the changes of sucrose content in‘Golden Delicious’fruit showed significantly negative correlation with fruit softening during storage. Sucrose Phosphate Synthase（SPS）activity was significantly correlated with firmness in‘Golden Delicious’，being accompanied with its higher expression level of MdSPS gene. Taken together，we concluded that starch degradation involved in fruit softening and had a close correlation with fruit storability，and SPS may play more important roles in sucrose metabolism during fruit softening in apple fruits and was also correlated with fruit storable characteristics.

Key words：apple；fruit；development；texture softening；sugar；starch；metabolism；gene expression

许多苹果品种的果实易于发酥变绵，质地软化，品质劣变。果实质地软化特性是制约苹果贮藏期的重要因子。苹果果实软化一般分3个阶段，即（Ⅰ）硬度缓慢下降、（Ⅱ）迅速下降和（Ⅲ）缓慢下降。第Ⅰ阶段与苹果果实贮藏期密切相关，但第Ⅱ阶段一旦启动，软化进程将难以控制（Prange et al.，1993），所以探讨前期软化的关键调控因子，有助于采取行之有效的贮藏保鲜技术来延长其贮藏寿命。目前关于影响苹果质地软化因子的研究主要集中在果实采后贮藏阶段的细胞壁降解、保护酶类及膜脂过氧化等方面，而关于糖和淀粉等碳水化合物代谢与果实质地软化的关系鲜见报道。

果实生长发育状况直接影响果实品质的形成，进而影响采后果实的贮藏特性，探讨采前果实质地发育状况对其采后贮藏的影响，将是果实软化机理研究的有益补充。糖和淀粉作为果实细胞的主要内含物质，其含量和比例的改变不仅影响果实风味品质，而且会显著影响果实细胞的膨压，进而通过影响果实细胞的张力而参与果实的软化进程（Itai & Tanahashi，2008）。目前对发育期果实碳水

，但其主要目的是为了弄清其与果实品质形成的关系，化合物代谢的研究很多（陈俊伟 等，2004）

而很少提及其与果实质地软化的关系。本试验中选取耐贮性差异显著的富士和金冠苹果，分析果实质地发育、糖和淀粉代谢及其关键酶基因表达的差异，探讨碳水化合物代谢与果实质地软化的关系，以期为果实品质改良和贮藏保鲜技术的改进提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2012—2013年在河北省燕山苹果产区进行。以耐贮藏的富士苹果和不耐贮藏的金冠苹果为试材，设单株小区，重复5次。从花后14 d开始采样，每14 d采样1次，直至果实成熟。依据果实成熟期，富士和金冠果实分别于花后170 d和140 d采收，散掉田间热后于常温（20 ± 1）℃和相对湿度90%的环境下贮藏。

采收当天测定相关指标，贮藏期间定期取样，用于硬度、糖与淀粉含量、酶活性和关键酶基因表达变化的测定。选取幼果期（Ⅰ）、细胞分裂期（Ⅱ）、细胞膨大期（Ⅲ）、内含物质积累期（Ⅳ）和成熟期（Ⅴ）的果实用于酶基因表达分析，其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别为富士花后28、56、98、126和154 d，金冠花后28、56、84、98和126 d。

齐秀东，魏建梅，李永红.

苹果果实质地软化过程中碳水化合物代谢及其关键酶基因表达的变化.

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1.2 果实硬度与糖和淀粉含量的测定

果实硬度采用GY-4型数显硬度计测定，重复10次。参照赵智中等（2001）的方法，分别称取2.0 g冷冻果肉，研磨，用80%乙醇80 ℃下水浴20 min，重复提取3次，集中上清液，蒸去乙醇，2 mL ddH2O溶解，0.25 µm微孔滤膜过滤，所得可溶性糖采用日本岛津高效液相色谱仪测定。色谱条件：CLC-NH2色谱柱和RID-10A示差折光检测器，柱温40 ℃，流速1.0 mL · min-1，流动相为85%乙腈，进样量10 µL。根据蔗糖、果糖和葡萄糖标准曲线和样品峰面积计算糖含量。将上述提取可溶性糖的残余物用高氯酸法提取淀粉，蒽酮比色法测定生成的葡萄糖含量，根据葡萄糖标准曲线计算淀粉含量。重复3次。

1.3 碳水化合物代谢相关酶活性的测定

酶液提取和活性测定参照Merlo和Passera（1991）、Itai和Tanahashi（2008）的方法。称取2.0

10 mmol · L-1 g冷冻果肉于冰浴中研磨，加6 mL HEPES缓冲液（pH 7.5，内含50 mmol · L-1 HEPES，

MgCl2，l mmol · L-1 EDTA，2.5 mmol · L-1 DTT，0.05%Tritonx-100和0.1%BSA），匀浆，过滤，4 ℃下12 000 r · min-1离心，上清液于4 ℃下透析12 h后用于酶活性测定。蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定以F-6-P和 UDPG为底物，37 ℃反应30 min，1 mol · L-1 NaOH终止，沸水浴5 min，冷却，加浓HCl和12%间苯二酚于80 ℃保温10 min，冷却，测定OD520值。蔗糖合成酶（SS）活性测定以UDPG和果糖为底物，37 ℃反应40 min，1 mol · L-1 NaOH终止，沸水浴5 min，冷却，加浓HCl和12%间苯二酚于80 ℃保温8 min，冷却，测定OD520值。酸性转化酶（AI）活性测定以蔗糖为底物，37 ℃反应40 min，加3,5–二硝基水杨酸终止反应，煮沸5 min，冷却，12 000 r · min-1离心，上清液用于测定OD520值。淀粉酶（AM）活性测定以可溶性淀粉为底物，37 ℃反应 20 min，用3,5–二硝基水杨酸终止反应，煮沸5 min，冷却，测定OD520值。以上均以煮死酶液作空白，分别以蔗糖和还原糖标准曲线计算酶活性。重复3次。

1.4 MdSPS和MdAM的表达量分析

果实总RNA的提取采用改良CTAB法。紫外分光光度计（UV-1700）下测定A260、A280、A230以及进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和完整性。蔗糖磷酸合成酶基因MdSPS和淀粉酶基因MdAM的定量引物设计采用Premier 5.0软件进行（表1）。用TaKaRa逆转录试剂盒进行cDNA第一链合成（RNA模板量500 ng）。采用iQTM5多重Real-time荧光定量PCR仪检测基因的定量表达情况。反应总体积20.0 µL，包括cDNA模板1.0 µL，SYBR® Premix Ex TaqTM（2×）10.0 µL，特异引物0.5 µL。采用三步法，即94 ℃ 5 min，94 ℃ 5 s，55 ~ 60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s（荧光检测），设40个循环。每次PCR均以内参基因18S为阴性对照。将采收时（0 d）的基因表达量设为1.0，数据分析用2-ΔΔCT方法进行。每次设平行管重复3次。

表1 苹果果实MdSPS和MdAM基因定量PCR引物序列

Table 1 Primers for the qPCR amplification of MdSPS and MdAM gene in apple fruit

基因名称Gene name

MdSPS

MdAM

18S 引物序列Primer sequence S5′ TATCAACGCAACCTACAAGA 3′ A5′ AGGCAACTAACTCCACGAC 3′ S5′ ACGAACATCAGCCACAGGAC 3′ A5′ CCGAACAAACTCAGAAAACG 3′ S5′ CCATTGGAGGGCAAGTCT 3′ A5′ GGTTCTCACGCTACACGA 3′

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Carbohydrate metabolism and the key gene expression in apple during fruit texture softening.

412 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：409–417. 1.5 数据统计分析

采用Excel软件进行数据计算和绘图，用DPS软件进行数据的Duncan’s多重检测。

2 结果与分析

2.1 苹果成熟软化期间果实硬度变化

由图1可知，随果实成熟，两品种果实硬

度均逐渐降低，但品种间存在显著差异。富士

果实采收前56 d至采收时硬度由17.1降至12.8

kg · cm-2，下降4.3 kg · cm-2，金冠果实则由16.2

降到11.1 kg · cm-2，下降5.1 kg · cm-2。富士果

实贮藏70 d硬度仍为9.2 kg · cm-2，果实质地

硬脆，贮藏品质良好；而金冠果实硬度下降较

快，贮藏42 d即降至5.3 kg · cm，果肉汁液

减少，质地疏松、发绵，品质下降。

2.2 果实可溶性糖与淀粉含量的变化

富士和金冠果实发育期间蔗糖、葡萄糖和果糖含量均表现相似的增加趋势（图2，A、B、C），其中，果糖含量最高，葡萄糖次之，蔗糖所占比例最低。然而，在贮藏期间，两品种果实蔗糖含量变化的差异最显著，即富士蔗糖含量的积累速率显著超过金冠（图2，A），而葡糖糖和果糖的变化趋势在品种间相似（图

2，B

、C）。

-2图1

苹果果实质地软化过程中的硬度变化 Fig. 1 Changes of flesh firmness with fruit texture softening in apple

图2 苹果果实发育和软化过程可溶性糖和淀粉含量的变化

Fig. 2 Changes of soluble sugars and starch contents in apple fruit during development and softening

齐秀东，魏建梅，李永红.

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图2，D显示，富士果实发育前期（花后14 ~ 70 d）淀粉积累较快，最高达42.01 mg · g-1FW，之后又迅速降解，采收时仅为1.87 mg · g-1FW，且贮藏期间基本不变；金冠果实淀粉含量的变化趋势与富士一致，即发育初期呈积累趋势，之后不断降解，采收时显著高于富士，为6.07 mg · g-1FW，进入贮藏期淀粉含量显著下降，至贮藏后期不再降低。

果实成熟期，两品种果实硬度变化与蔗糖、果糖和葡萄糖含量显著负相关，贮藏期间只与金冠蔗糖含量显著负相关；两品种果实硬度均与淀粉含量变化显著正相关，在金冠上的相关性大于富士（表2）。

表2 苹果果实硬度与糖和淀粉含量的相关性分析

Table 2 Correlation analysis between fruit firmness and the contents of soluble sugar and starch

品种

Cultivar

富士Fuji

金冠Golden Delicious

时期 葡萄糖 Stage Glucose 成熟期Maturation –0.969 贮藏期Storage 0.413 成熟期Maturation –0.965** 贮藏期Storage 0.991 果糖 Fructose –0.724 0.078 –0.991** 0.707 蔗糖 淀粉 Sucrose Starch –0.977 0.813 –0.361 0.749* –0.875** 0.868** –0.849** 0.781*

注：*显著线性相关，**极显著线性相关。

Note：* and ** indicate significant linear correlation of 0.05 and 0.01 levels，respectively.

2.3 果实蔗糖代谢相关酶和淀粉酶活性的变化

富士果实发育前期蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性低且稳定，进入果实膨大期（花后70 ~ 112 d）后明显上升，成熟期和贮藏期维持在较高水平；金冠果实发育前期SPS活性变化与富士相似，花后56 d达高峰后表现明显下降的趋势，进入成熟期呈增加趋势，贮藏期间显著增加（图3，A）。

蔗糖合成酶（SS）尽管一直表现较高活性，但在果实成熟期和贮藏期略有下降，且两品种间的差异不显著（图3，B）。

图3 苹果果实发育和软化过程蔗糖代谢相关酶和淀粉酶活性的变化

Fig. 3 Changes of SPS，SS，AI and AM activities in apple fruit during development and softening