PCR法检测食用植物油中动物源性成分

粮油食品科技第21卷2013年第4期

生物工程

PCR法检测食用植物油中动物源性成分

王立平，刘晓莉，曹

悦，蔡雪凤，张

帆

(国家食品质量安全监督检验中心，北京100094)

要：针对目前国家标准无法鉴别食用植物油是否掺入动物油脂的问题，尝试用PCR法测定植

物油中动物源性成分，鉴别是否掺入动物油脂，为食用植物油监管，特别为治理在食用植物油中掺摘

入地沟油的非法行为提供技术支持。

关键词：食用植物油;动物源性成分;多聚酶链式反应中图分类号：TS227

文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2013）04－0095－04

Detectionofanimal－derivedingredientsinediblevegetableoilsbyPCRmethod

WANGLi－ping，LIUXiao－li，CAOYue，CAIXue－feng，ZHANGFan（NationalFoodQualitySupervisionandInspectionCenter，Beijing100094）

Abstract：Sincethereisnonationalstandardmethodtodetecttheanimal－derivedingredientsinediblevegetableoil，polymerasechainreaction（PCR）methodwasattemptedtobeusedtodeterminetheanimal－derivedingredientsinediblevegetableoilinordertodistinguishifitwasadulterated．Thenewlydevel-opedmethodprovidedtechnicalsupportforsupervisionofediblevegetableoil，especiallytheoiladultera-tedwithrestaurantwasteoil．

Keywords：ediblevegetableoils；animal－derivedingredients；polymerasechainreaction随着人们生活水平的提高及健康意识的增强，对食用植物油消费量日益增加。不法商家将地沟油按一定比例添加到新鲜食用的植物油中，谋取暴利，危害消费者健康。地沟油分为三类：一是狭义的地即来自于餐饮企业的剩菜、剩饭使用后排到下沟油，

水道里，由不法商贩利用隔油器收集的潲水油；二是皮及经简单加工利用劣质猪屠宰加工厂动物内脏、

肉及工厂炼制的废弃动物油脂；三是经过多次反复使用超过规定使用次数的煎炸油脂

［1］

过热循环，实现对目的基因片段的大量扩增。因其灵敏、特异性高等特点，已被广泛应用于具有快速、

食品成分掺假鉴别检测中

［2－4］

。基于地沟油的来

动物油脂中会残留有动物DNA片段。正常植物源，

油中不应含动物源性成分，通过PCR手段扩增植物油中的动物基因片段，经琼脂糖电泳，通过目标条带的有无则可判定食用植物油中是否掺有动物油脂。因此，本研究以对纯植物油中添加动物油脂为研究通过摸索确定样品提取的最适条件，建立对象，

PCR技术测定植物油中动物源性成分方法。

。现行的国

家食用油检验标准与检测方法只是对酸价和过氧化不能确定食用油中的外源动值等理化指标的检测，

物成分。而且经过加工后的废弃油脂，其色泽、气味、滋味等感官指标，以及酸价和过氧化值等理化指标常接近或完全符合国家《食用植物油卫生标准》（GB2716—2005），掺混后与正常食用植物油难以探索一种快速、有效、准确的地沟油检区分。因此，查方法势在必行。

PCR（PolymeraseChainReaction）技术主要是通

收稿日期：2012－12－03

基金项目：北京市科学技术委员会项目（Z111100074211019）

1968年出生，作者简介：王立平，女，博士，高级工程师．

1

1．1

材料与方法

材料

提取DNA材料

动物组织：猪、牛、羊、鸡、

1．1．1

鸭、鹅、鱼、狗。植物种子：主要包括常见油料作物，如，玉米、花生、大豆、葵花籽及油菜籽。制备样品基60℃温浴成液态质：大豆油（自榨）。猪油脂：自榨，后，再进行DNA提取。1．1．2

试剂

2×TaqMasterMix、DNAmarker

（50bp～450bp）、TE缓冲液：天根生物技术公司；GelRed染液；DNA提取试剂盒：香港海康公司；琼糖。

生物工程

1．1．3

仪器

离心机：Sigma3K18；核酸蛋白分析

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凝胶浓度为2．0%。电泳后，置于GelRed染液中染色40min，在凝胶成像系统观察结果。1．2．31．2．3．1

样品中DNA提取方法提取液的确定

TE缓分别采用灭菌水、

仪：EppendorfBioPhotometerPlus；电泳仪、凝胶成像系统：Bio－rad。1．21．2．1

方法样品制备

以大豆油为基质，将猪油用大豆

冲液及TE+NaCl溶液（TE中NaCl浓度为1．0mol/L）作为提取液溶解样品中DNA。2mL体积离心管中加入1．0mL三种提取液，再加入1．0g熔化12000r/min离心10的猪油，室温下振摇10．0min，min，弃上层油脂，再次向同一支离心管中补足新样

15%、10%、油分别稀释至含量（W/W）为20%、

5%、1．0%、0．5%，提取各样品DNA后，用于植物油中动物源性成分的检出限测试。1．2．21．2．2．1

PCR检测

PCR扩增体系及反应条件

PCR采用线

［8］品1g，重复5～10次。可采用改良CTAB法和

粒体16SrDNA为靶序列的引物（见表1）。由上海英骏生物工程技术服务公司合成。

表1

引物名称动物通用1

DNA提取试剂盒（操作按试剂盒说明进行）提取水相中的DNA。1．2．3．2

提取时间

30、60振摇时间分别设为10、

以猪油含量为1．0%植

min。提取DNA，扩增后比较结果。1．2．3．3

样品提取体积

20、30、50mL样品DNA，物油为样品，分别提取10、扩增后比较结果。1．2．4

高温对DNA片段影响

将猪DNA（片段长

度为212bp）混入植物油中，一部分样品加热至180℃，40、60min取出，分别于5、迅速冷却至室温；另一部分样品加热至210℃，分别于0min和55min取出，迅速冷却至室温。提取DNA，琼脂糖电泳检测DNA受损状况。

用于检测动物成分线粒体基因的引物

引物序列

片段长度

文献来源

F：5’－AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA－3’R：5’－GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA－3’

F：5’－AGGGATAACAGCGCAAT－3’R：5－GTTCTTGAACTCAGATCACGTAGGACT－3’F：5’－GCCTAAATCTCCCCTCAATGCTA－3’R：5’－ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG－3’

’

234～262bp参考文献［5］

动物通用2149bp参考文献［6］

猪212bp参考文献［7］

普通引物1的PCR扩增体系总体积25μL，含2×TaqMasterMix12．5μL；引物终浓度0．2μM；基因组模板100～200ng。PCR反应程序为94℃，5min；94℃，30s；60℃，30s，72℃，30s，35个循环。72℃延伸7min。4℃保存。

普通引物2的PCR扩增体系总体积25μL，含2×TaqMasterMix12．5μL；引物终浓度0．2μM；基因组模板100～200ng。PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；57℃，30s，72℃，30s，30个循环。72℃延伸4min。4℃保存。

猪特异性引物PCR扩增体系总体积25μL，含2×TaqMasterMix12．5μL；引物终浓度0．2μM；基因组模板100～200ng。PCR反应程序为：94℃，3min；94℃，45s；56℃，45s，72℃，45s，35个循环。72℃延伸5min。4℃保存。1．2．2．2

通用引物特异性

分别采用不同种类动

PCR扩增后，物DNA和主要油料作物DNA为模板，采用琼脂糖电泳检测扩增结果。1．2．2．3

琼脂糖检测

取10．0μL普通PCR扩增

PCR产物电泳检测所用的产物上样进行电泳分析，

2

2．1

结果与分析

动物通用引物2特异性

提取不同动物和主要油料作物DNA，采用动物

通用引物2进行PCR扩增，结果见图1和图2。从动物通用引物对动物DNA有图1和图2中可看出，

良好的特异性，扩增产物在琼脂糖有清晰条带；而植物DNA扩增产物在琼脂糖未呈现条带。由此可见，动物通用引物2可用于下一步实验中

。

M：50bpladder；1：空白对照；2和10：阳性对照（牛）；3：油菜籽；

4：大豆；5：玉米；6：葵花籽；7：橄榄；8：花生；9：芝麻。图1

植物DNAPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

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DNA扩增产物在琼脂糖上条带颜色越深。由此可见随着振摇时间的延长，有更多的DNA溶入。振摇时间最低不能少于10min。但考虑时间成本，具体时间可根据实验时具体情况而定。2．4

不同提取体积结果比较

分别提取以猪油含量为1．0%植物油为样品，

M：50bpladder；1：空白对照；2：猪；3：羊；4：牛；

5：鸭；6：鸡；7：狗；8：鹅；9：鱼。

图2

各动物DNAPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

10、20、30、50mL样品DNA，扩增后比较结果。从图5中可见，DNA扩增产物在琼随着提取体积的增加，至少脂糖上条带颜色越深。从本样本的情况而论，需要提取20mL的体积的DNA才能满足检测的需要

。

2．2不同DNA提取液提取效果比较

TE缓冲液及TE+NaCl溶液分别采用灭菌水、

作为提取液抽提样品中DNA，并以提取纯化的DNA为模板，采用通用引物1进行PCR扩增，结果见图3。从图3中可知灭菌水、TE缓冲液及TE+NaCl溶但三者间抽提效液都能有效将油脂中的DNA抽提，

率有所差异。从电泳图谱中条带颜色深浅可确定TE缓冲液提取效果较好，因此，将TE缓冲液作为样品DNA提取液

。

M：50bpladder；1、2：空白对照；3：阳性对照；4、5：水30mL；6、7：TE20mL；8、9：TE10mL；10、11：TE+NaCl10mL；12、13：TE50mL；14、15：TE30mL；16～18：水50mL。

图5

不同提取体积结果比较

2．5高温加热对DNA片段的影响

高温可导致DNA片段的断裂。从图6中可知，

180～210℃高温确实对DNA片段有极大损伤。高

M：50bpladder；1：空白对照；2～4：阳性对照；5～8：纯猪油－水；

9～12：纯猪油－TE；13～16：纯猪油－TE+NaCl。

图3

不同DNA提取液提取效果比较

温处理后提取DNA琼脂糖电泳图上条带颜色较对照（未经高温加热）条带浅很多。随着高温时间的DNA损伤越严重。尽管DNA链有一定的断延长，

对后续PCR有一定影响，但残留的DNA裂和降解，

仍然具有可检测性

。

2．3不同提取时间结果比较

30、60min。提取DNA，振摇时间分别设为10、

扩增后比较结果。在图4中随着振摇时间的延长

，

M：50bpladder；1、2：空白对照；3、4：阳性对照；5、6：1～10min；7、8：1～30min；9、10：1～60min；11、12：2～60min；13、14：2～10min；15、16：1～30min。

图4

不同提取时间结果比较

图6

1、2：空白对照：3、4：阳性对照；5、6：210℃，55min；7、8：180℃，40min；9、10：180℃，60min；11、12：210℃，0min；

13、14：180℃，5min。

高温处理DNAPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

生物工程

2．6

确定检出限

将1．2．1中配制的样品提取DNA后，用通用引琼脂糖电泳染色后观察结果，物2进行PCR扩增，

结果见图7a。如图所示，分别掺有1%以上猪油脂的大豆油DNA均扩增出149bp大小的目的片段。结果显示通用引物2能检测到植物油中1%（W/W）的动物成分。将含1%猪油脂的大豆油DNA用猪特异性引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳染色后观察结果，结果见图7b。如图所示，琼脂糖电泳图有212bp猪目标片段，进一步印证了通用引物2PCR扩增结果

。

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通常也需要几分钟，由此可知，残留的动物源性DNA降解更为严重。而回收油脂经过加热、脱色及脱臭等步骤，对残留的DNA也会造成一定程度的破坏。图6电泳图展示不同温度处理DNA条带深浅变化。即使是很短的片段（200bp左右），在高温加热过程中仍不可避免遭到破坏。Fairborther等（1998）发现PCR具有从高度降解的DNA中扩增出短片段的能力

［11］

。因此，利用PCR手段检测植物

油中动物源性成分时应尽可能扩增短DNA片段，提高检测准确性和灵敏度。

4结论

本研究采用动物通用引物，通过PCR手段初步

可以快速、准筛查植物油中是否含有动物源性成分，

确的检测出食用植物油中1．0%（W/W）的动物源性成分。可作为食用植物油中掺杂动物源性成分检测方法之一。参考文献：

［1］2006，（12）：11．王梅．杜绝食用地沟油［J］．人生与伴侣：新养生，［2］杨冬燕，杨永存，杨小柯，等．物种特异性基因扩增鉴别掺假食用

2011，21（9）：2120－2125．植物油［J］．中国卫生检验杂志，

［3］ROJASM，GONZLEZI，FAJARDOV，etal．Identificationofraw

andheat－processedmeatsfromgamebirdspeciesbypolymerasechainreaction－restrictionfragmentlengthpolymorphismofthemito-J］．PoultryScience，2009，（88）：669－679．chondrialD－loopregion［

aM：50bpladder；1：空白对照；2：阳性对照；

3：50%；4：10%；5：15%；6：20%；7：0．1%；8：0．5%；9：1．0%。

bM：50bpladder；1：空白对照；2～4：阳性对照；

5～8：纯猪油－水；9～12：纯猪油－TE；13～16：纯猪油－TE+NaCl。

图7

PCR方法检测动物源性成分检测限

［4］LI－CHINT，MEI－TZUH，CHUNG－TINGH，etal．Speciesiden-tificationofanimalspecimensbycytochromebgene［J］．Forensic2007，6（1）：63－65．ScienceJournal，

［5］BOTTEROMT，CIVERAT，NUCERAT，etal．Designofuniversal

．Proquestprimersforthedetectionofanimaltissuesinfeedstuff［J］AgricultureJournal，2003，（27）：667－669．

［6］田力，宋小红，云利兵，等．线粒体16srRNA和ND4基因在种属鉴

2006，21（5）：272－273．定中的应用研究［J］．中国法医学杂志，

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S］．方法［

［8］．中国：陈彦，王亚．一种食用植物油中残留DNA的提取方法［P］

CN101100479A，2008．

［9］EBBEHJKF，THOMSENPD．Differentiationofcloselyrelatedspecies

byDNAhybridization［J］．MeatScience，1991a，30（4）：359－366．［10］EBBEHJKF，THOMSENPD．Speciesdifferentiationofheated

meatproductsbyDNAhybridization［J］．MeatScience，1991b，30（3）：221－234．

［11］FAIRBORTHERKS，HOPWOODAJ，LOCKLEYAK，etal．Theac-tinmultigenefamilyandlivestockspeciationusingthepolymerase

PCR

3讨论

16SrRNA基因是线粒体基因在线粒体DNA中，

组中研究较多的基因，既含有保守序列，又含有可变序列，且拷贝数多，被广泛用于种类鉴定中

［6］

。在

基于动物线粒体16SrRNA基因序列设计本研究中，

的通用引物都具有较好的特异性。但考虑到地沟油生产加工过程中DNA的降解及断裂，扩增目标片段越短越好。因此，通用引物2可用于动物源性成分的PCR手段测定。

核酸具有热变性，随着温度升高由双链解旋成单链。如果温度太高，单核苷酸间磷酸二酯键断裂，导致DNA断裂形成小片段。Ebbehj和Thomsen等研究发现，当肉加热到100℃时DNA降解为1100bp左右的片段，加热到120℃时DNA降解至600bp以下

［9－10］

chainreaction［J］．AnimalBiotechnology，1998，9（2）：89－100．●

。炸油温度一般为160～180℃，油炸时间