不同工艺制备的白术多糖对小鼠血清中细胞因子的影响_陈红伟

第３自然科学版）７卷第１期　　　　　　　　　西南大学学报（０１５年１月　　　　　　　　　　　２Ｖｏｌ．３７　Ｎｏ．１）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ　　　　　ｙ（Ｊａｎ．０１５　２

：／．ｃｎｋｉ．ｘｄｚｋ．２０１５．０１．００９ＤＯＩ１０．１３７１８ｊ

不同工艺制备的白术多糖对

小鼠血清中细胞因子的影响①

陈红伟，　何　俭，　黄庆洲，　刘　娟，

吴俊伟，　魏述永，　张志强

西南大学（荣昌校区）动物医学系，重庆４０２４６０

摘要：研究白术在不同制备工艺条件下得到的白术多糖（对小鼠血清中细胞因子的影响，采用传统水提和超ＰＡＭ）

，以苯酚硫酸比色法测定多糖含量．通过腹腔注射环磷酰胺，建立免疫抑制模型，将提取声法提取白术多糖（ＰＡＭ）

，观察Ｐ的ＰＡＭ连续灌胃小白鼠１４ｄＡＭ对小白鼠血清中ＩＬ２，ＩＬ４和ＩＦＮ－－－γ含量的影响．结果发现，两种方法提

取的ＰＡＭ对小鼠日增质量和免疫器官指数的影响不明显，但均能极显著提高免疫低下小鼠血清中ＩＬ４的含量．－

结果表明，传统水提和超声法提取的ＰＡＭ均能在不影响生长性能的基础上，促进小鼠血清中细胞因子ＩＬ４的表－

达，缓解免疫应激，提高机体免疫功能，但水提法优于超声提取法．

关　键　词：白术多糖；细胞因子；小白鼠；制备工艺

（）中图分类号：Ｑ６７３９８６８２０１５０１００６００５９４９．７８３．５　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１－－－

白术为菊科植物白术Ａ浙八味”之一，为最常ｔｒａｃｔｌｏｄｅｓｍａｃｒｏｃｅｈａｌａＫｏｅｄｚ的干燥根茎，是著名的“　　ｙｐ

１］用的补益中药，有“南术北参”美称，具有健脾益气、益胃、燥湿利水、和中、止汗、安胎之功效［．白术多

［２］，Ｐ系白术植物原料中提取的水溶性多糖，目前糖（ｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＡｔｒａｃｔｌｏｄｅｓｍａｃｒｏｃｅｈａｌａＡＭ）　　　ｐｙｙｐ

［］［，］ＰＡＭ的提取方法主要有水提法、超声提取法、酶法等３－５．ＰＡＭ对动物免疫功能的影响早有报道１６－８，

也是其药用价值之所在．但ＰＡＭ提取工艺的筛选多采用多糖的得率或含量来作为评价指标，而实际上这些多糖多为粗品，不同提取方法得到的ＰＡＭ对机体免疫功能的影响是否存在差异鲜有报道，而以免疫学指标作为评价指标来指导ＰＡＭ制备工艺的研究尚未见报道．本文拟采用水提和超声提取法提取白术多糖，并通过比较其对小白鼠生长性能、免疫器官指数、血清中细胞因子水平等指标来综合评价该制备工艺．１　材料与方法

１．１　主要药品与试剂

白术：重庆腾马中药饮片厂，相对湿度为４５％～７５％；小鼠ＩＬ２，ＩＬ４和ＩＦＮ－－－γ检测试剂盒为ＢＯＳＴＥＲ公司产品；环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司生产；试验日粮：武汉市万千佳兴生物科技有限公司．

１．２　主要仪器

；天平（；超声机（酶联免疫检测仪（上海越平科学仪器）宁波新芝生ＢＩＯ－ＲＡＤ公司、美国ＢＬＯ－ＲＨＤ）

收稿日期：２０１３０７１４－－

）；重庆市科委自然科学基金（；公益性行业（基金项目：中央高校基本科研业务费专项基金（农业）ＸＤＪＫ２０１２Ｃ０９９ＣＳＴＣ２０１２ＪＪＡ８００１３）

）科研专项经费（２０１３０３０４００５．－

，男，四川宜宾人，博士，副教授，主要从事新兽药研究．作者简介：陈红伟（１９８０－）①

第１期　　　　　陈红伟，等：不同工艺制备的白术多糖对小鼠血清中细胞因子的影响物科技股份有限公司）等．

１．３　试验动物

，雌、雄各半，体质量８～１断奶ＫＭ小白鼠（西南大学荣昌校区实验动物科提供）２ｇ．

１．４　试验方法

１．４．１　水提法６１

，加２，提取次数２选取白术材料粉碎成粗颗粒，准确称取１每次２ｈ）００ｇ５倍量的水，提取时间４ｈ（

（次，合并煎煮液、加１和饱和Ｂ约１以沉淀蛋白、振摇静止，上清液０％ＺｎＳＯ２０ｍＬ）ａＯＨ）５０ｍＬ）４约（２（

（加几滴ＢａＯＨ）００ｍＬ，静置１２ｈ，再除去沉淀，加４倍量９５％乙２直至无沉淀产生，过滤，滤液浓缩至２

［］醇，静置１２ｈ，抽滤，再用９５％乙醇洗涤，减压抽滤，真空干燥即得白术粗多糖３．

１．４．２　超声法

，加２，收集提选取白术材料并粉碎成细颗粒，准确称取１００ｇ０倍量的水，在５０℃条件下超声４５ｍｉｎ

取液，过滤得到滤液，按ｓ氯仿∶正丁醇＝５∶１）ｅｖａ３０ｍＬ脱蛋白，加入３倍量的９５％乙醇，静置ｇ法（

１２ｈ，过滤取沉淀，用丙酮和乙醚洗涤，干燥，得灰白色粉末状白术粗多糖５．

１．４．３　白术多糖的鉴别—纸色谱法

，放置小烧杯中，同时精密称取葡萄糖标准品１，放置另一个小烧杯中，精密称取多糖１０．７ｍ０．６５ｍｇｇ

／向两烧杯中同时加入２ｍｏｌＬ　Ｈ２ＳＯＬ，将其同时置１１０℃烘箱中烘８ｈ，水解多糖，得单糖，向两烧杯４３ｍ

［９］中加入约０．２ｇＢａＣＯ．３，中和硫酸，离心，得上清液，然后做纸层析实验　［］

点样：用两毛细管分别取烧杯中的上清液，点在已画好基线的纸层析滤纸上．

展开：取正丁醇、丙酮、水（的展开剂，置纸层析展缸中，将滤纸放进展缸，展开．取出，放４∶１∶５）

干．

显色：现配显色剂苯胺－邻苯二甲酸试剂，取０．９３ｇ苯胺及１．６６ｇ邻苯二甲酸溶于１００ｍＬ水饱和的正丁醇中，混匀．应用：将显色剂喷在滤纸上后，１０５℃加热５ｍｉｎ，两斑点均显棕色或桃红色，说明实验为阳性．

０１．４．４　苯酚－硫酸法测定含量１

（）标准溶液的制备１［］

，置１取经１０５℃干燥至恒定质量的葡萄糖１００ｍ００ｍＬ容量瓶中加水溶解，并稀释至刻度，摇匀．ｇ

［１］／精密量取１０ｍＬ，置１００ｍＬ容量瓶中，加水至刻度，摇匀，配成０．１ｍｍＬ的葡萄糖标准溶液１．ｇ

（）标准曲线的绘制２

准确吸取葡萄糖标准溶液０．１～０．６ｍＬ共６份，分别置于试管中，加蒸馏水补充至２ｍＬ，再加５％苯

，置８酚溶液１．０ｍＬ，摇匀，迅速加浓硫酸５．０ｍＬ，摇匀，放置５０ｍｉｎ０℃水浴中加热１５ｍｉｎ，取出，迅速

１２］冷却至室温［为横坐标，．另以２．０ｍＬ的蒸馏水作空白对照，在５９０ｎｍ波长处测定吸光度，以浓度（Ｃ）

以吸光度（为纵坐标，绘制标准曲线，求出回归方程为Ａ）

２（）４．６３７ｘ－０．００２２，ｒ．９９８２ｎ＝６＝０　　ｙ＝１

）白术多糖含量的测定３　　（

，置于５称取提取后并干燥至恒定质量的白术粗多糖５０ｍ０ｍＬ容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至ｇ

／刻度，摇匀，准确吸取１０ｍＬ，置于１００ｍＬ容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配成０．１ｍｍＬ的ｇ

溶液．取上述溶液０．５ｍＬ按标准曲线绘制时的方法处理，并测出吸光度，将吸光度带入回归方程求出其含量．

１．５　试验动物与试验设计

本试验采用完全随机区组设计，将３０只体质量相近、健康的断奶ＫＭ小白鼠，按体质量随机分为４个处理组：超声提取组、水提组、空白生理盐水对照组、环磷酰胺处理的模型组，每个组６只小鼠，剩余６只

，各试验组小鼠每日定时灌胃１次，根据粗品中多糖含量进行计算，按每ｋ作０ｄ对照，试验期１４ｄｇ体质

，灌胃量均为１／量灌胃ＰＡＭ４０ｍ０ｍＬｋ．在灌胃第２天除空白对照组外，各组小鼠均腹腔注射环磷酰　ｇｇ

１３］／，，连续５ｄ，制备免疫低下小鼠模型［胺５０ｍｋ１次／ｄ．与此同时，空白对照组和模型组均按相同剂量ｇｇ

６２

／／西南大学学报（自然科学版）ｔｔｘｂｂｂ．ｓｗｕ．ｃｎ７卷　　　　　ｈ　　　　　第３ｐ：ｊ

灌胃生理盐水．试验第０，１４天称质量，每个处理组共６只小白鼠，末次给药１２ｈ后眼球采血致死，称脾和胸腺质量，取血清测定细胞因子ＩＬ２，ＩＬ４和ＩＦＮ－－－γ的含量．１．６　试验动物饲养管理

，自由饮水，试验日粮按舍内温度控制在２２～２６℃，保持通风，严格控制光照（１２ｈ光照，１２ｈ黑暗）／／只，第二周５ｇ／／只连续饲养２周．第一周４ｇｄｄ１．７　测定项目与方法

的测定１．７．１　小鼠平均日增质量（ＡＤＧ）

按下面公式计算小鼠日增质量：

］／（）小鼠日增质量（杀前各组小鼠的总质量（小鼠只数×１４－杀后各组小鼠的总质量（ｇ）＝［ｇ）ｇ）１．７．２　免疫器官指数的测定

小鼠连续灌胃后，称其体质量，眼球采血致死，取出胸腺和脾脏，用滤纸吸干血迹后称其质量，算出胸腺和体质量、脾脏和体质量之间的比值．

１．７．３　小鼠血清中细胞因子含量的检测

眼球摘除法放血，采集血液，分离血清备用．采用ＥＬＩＳＡ法测定小鼠血清中ＩＬ２，ＩＬ４，ＩＦＮ－－－γ含量，取１００μＬ血清稀释３倍后加入酶标板，具体操作严格按ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书完成．结果判定：根据标准品Ａ值绘制标准曲线并求出方程，通过样本Ａ值计算出ＩＬ２，ＩＬ４，ＩＦＮ－－－γ的含量．１．８　统计学处理

数据采用ＳＰＳＳ１９．０统计软件，统计数据以ｘ±ｓ表示，采用ＯｎｅＷａＡＮＯＶＡ分析，并用Ｄｕｎｃａｎ比　ｙ　较各数据间的差异，．０５视为２组数据间存在显著性差异．ｐ＜０

２　试验结果

２．１　水提取法和超声提取法提取白术多糖经鉴别实验均为阳性反应，多糖含量测定结果为水提法多糖含量为１２．５７％，超声提取法多糖含量为１０．５２％．２．２　白术多糖对小鼠平均日增质量的影响

数据统计结果见表１，与模型组比较，超声提取、水提取的白术多糖均提高了小鼠的日增质量，但差异均不显著．

）表１　小鼠平均日增质量统计结果（Ｍｅａｎｓ±ＳＤ，ｎ＝６

ｇ

２．３　白术多糖对小鼠免疫器官指数的影响

统计结果见表２，与模型组比较，超声提取、水提取的白术多糖提高了小鼠的脾脏指数和胸腺指数，但差异均不显著．

）表２　小鼠脾脏、胸腺指数统计结果（Ｍｅａｎｓ±ＳＤ，ｎ＝６

组　别空白组模型组水提组超声组

３．００±０．１６　

脾脏指数

第０天

第１４天２．８５±１．００　２．２５±０．７６　３．１３±１．７９　２．７４±１．６０　

４．０７±０．３５　第０天

胸腺指数

第１４天１．７９±１．０１１．６３±０．２１２．８２±０．７４２．６１±０．２０

－１

·ｇｍ　ｇ

，２．４　白术多糖对小鼠血清ＩＦＮＩＬ２和ＩＬ４水平的影响－γ－－

统计结果见表３，与ＣＴＸ组比较，ＰＡＭ对小鼠血清ＩＦＮＩＬ２水平均有促进作用，但差异不显著；－γ，－与ＣＴＸ组和Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较，超声提取、水提取的ＰＡＭ均极显著提高了ＩＬ４的含量．另外，水提组对３－

第１期　　　　　陈红伟，等：不同工艺制备的白术多糖对小鼠血清中细胞因子的影响种细胞因子的促进作用略高于超声组，但差异不显著．

）表３　小鼠血清中的γＩＦＮ，ＩＬ２，ＩＬ４含量（Ｍｅａｎｓ±ＳＤ，ｎ＝６－－－

组　别空白组模型组水提组超声组

ＩＦＮγ－

第０天

第１４天４６４．４８±５６．５６　

１６８．２６±１６．７３７５．９３±４４．８４　３

４１７．８３±６４．６０　３９０．１４±９２．４８　

ＮＤ　第０天

ＩＬ２－

第１４天１０９．３１±６．０２　１１３．０４±１４．２４　１２１．２２±１１．３０　１１６．８１±１７．０９　

８５．０９±８．４７　

６３

·ｍＬ－１　ｐｇ

／（·ｍＩＬ４Ｌ－１）－ｐｇ第０天第１４天

ΔΔ

９５．５７±６．９９

１４．７１±１．９９

ΔΔ＊＊１２７３．２６±２６．９３ΔΔ＊＊１２２２．６６±６１．８１

Ｄ表示未检测到；与空白组对照＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，与环磷酰胺组对照Δｐ＜０．０５，．０１．　　注：ＮΔΔｐ＜０

３　分析与讨论

６］１４］

，毛俊浩等［白术为临床常用中药，白术多糖对机体体液免疫、细胞免疫和细胞因子均有调节作用［

在小鼠的淋巴细胞上验证了ＰＡＭ促进淋巴细胞分泌ＩＬ２的作用，并且对免疫抑制小鼠淋巴细胞的增殖能－

１５］

研究证明适当添加剂量的白术及Ｐ力有恢复作用．胡晓蕾等［ＡＭ可显著提高小鼠血清ＩＧ水平，并对ｇ

ＩＭ，ＩＡ水平及血清补体Ｃ３，Ｃ４水平均有提高的趋势．ｇｇ

目前，关于ＰＡＭ提取方法的筛选多以多糖含量或得率作为评价指标，而提取纯化的ＰＡＭ多为粗多

５］

，并非结构确切的单体成分，在对机体免疫力影响方面是否存在差异值得探讨，也就是说多糖含量高糖［

或得率高的提取物并不意味着生物活性就高，因此在筛选多糖提取方法时，除了考察多糖含量和得率，还

１６］

采用了单核细胞直接细胞毒性测定法检测板蓝根多糖对小鼠脾细胞增需评价其生物活性．比如，马莉等［

殖反应的影响，在免疫活性的基础上筛选物质基础，优选板蓝根多糖制备工艺．因此，本文采用了常见的水提和超声提取法提取白术多糖，并通过比较其对小白鼠生长性能、免疫器官指数、血清中细胞因子水平等指标来综合评价制备工艺．

小鼠日增质量是小鼠生长的重要指标，从表１可见与环磷酰胺模型组比较，超声提取、水提取的白术

１５］

多糖均提高了小鼠的日增质量，但差异均不显著．这与胡晓蕾等［的研究基本一致，０．２％白术多糖有提

高小鼠日增质量的趋势，但统计学上差异不明显．脾脏是Ｔ、Ｂ淋巴细胞定居并接受抗原刺激后产生免疫

７］

，两者是机体最重要的免疫器官，而器官指数作为一个反应的场所，胸腺是Ｔ淋巴细胞分化成熟的场所［

发育情况的重要指标，常被用于机体发育方面的研究．本试验发现，与模型组比较，超声提取、水提取的白术多糖均提高了小鼠的脾脏指数和胸腺指数，但差异均不显著．细胞因子的产生也是机体免疫反应的一项主要指标，Ｔ细胞亚群的区分主要是通过细胞因子的状态来区分的，Ｔｈｌ细胞主要产生ＩＦＮＩＬ２和淋－γ，－

［７］

巴细胞毒素；而Ｔｈ２细胞主要产生ＩＬ４，ＩＬ５，ＩＬ１０，ＩＬ１３１．正常情况下，Ｔｈ１和Ｔｈ２细胞亚群借助其－－－－１８］分泌的细胞因子形成负反馈，相互制约，维持机体免疫系统的平衡［．现阶段有多种技术可用于检测细胞［９］因子的产生，最常用的方法是ＥＬＩＳＡ，其主要优点是快捷简便，结果易分析１．本试验采用ＥＬＩＳＡ法检测

后发现，与空白组和模型组比较，两种提取方法得到的ＰＡＭ极显著提高了小鼠血清中ＩＬ４的含量，而对－

［４］

验证了ＰＩＦＮＩＬ２的影响不显著，推测ＰＡＭ可能有促进Ｔｈ２类细胞分化的作用，这与毛俊浩等１ＡＭ－γ，－

有促进小鼠淋巴细胞分泌ＩＬ２作用的结论不一致，可能的原因是在ＰＡＭ剂量或作用时间不同的情况下，－

随着Ｔｈ１类细胞的不断分化，在机体负反馈机制的作用下，Ｔｈ２类细胞通过分泌ＩＬ４以抑制Ｔｈ１类细胞－／的增殖与功能，使Ｔｈ１Ｔｈ２达到一定平衡，具体机制还有待进一步研究．

传统水提和超声提取白术多糖是两种截然不同的提取方法，经测定发现水法提取白术多糖的含量高于超声提取法，两种提取方法得到的ＰＡＭ均极显著提高了小鼠血清中ＩＬ４的含量，但从对小鼠日增质量、－免疫器官指数、血清中细胞因子水平影响的总体趋势来看，水提法均优于超声提取法，因此建议白术多糖的提取可优先选择传统水提法．参考文献：

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ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＡｔｒａｃｔｌｏｄｅｓｍａｃｒｏｃｅｈａｌａＰｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　　ｙｐｙ

ＰｒｏｄｕｃｅｄｂＤｉｆｆｅｒｅｎｔＰｒｅａｒａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｉｅｓ　　　ｙｐｇ　

ｏｎＣｔｏｋｉｎｅｓｏｆＭｏｕｓｅＳｅｒｕｍ　　　　ｙ

，，，，ＣＨＥＮ　ＨｏｎｅｉＪｉａｎＱｉｎｚｈｏｕＩＵ　Ｊｕａｎ－ｗ　ＨＥ　　ＨＵＡＮＧ　－　Ｌｇｇ

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，ＤｅａｒｔｍｅｎｔｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔＲｏｎｃｈａｎＣａｍｕｓ）Ｃｈｏｎｉｎ４０２４６０，Ｃｈｉｎａ　　　ｐｙ　ｙ（ｇｇｐｇｑｇ　　

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ａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｉｅｓｏｎｃｔｏｋｉｎｅｓｏｆｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍ．ＰＡＭｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄ　　　　　　　　　　　　ｇｙｙ　

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ＰＡＭｏｎＩＬ２，ＩＬ４ａｎｄＩＦＮｎｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍ　ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｏｒａｌｌｉｎｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎ１４　　－－　－γｉ　　　　　　ｙｇｙｇ　　　　ｄａｓ．ＩｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅＡＤＧａｎｄＯｒａｎｉｎｄｅｘｏｆｅａｃｈｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｏｕｍｉｃｅｗｅｒｅｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｃｏｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　－ｙｇｐｇｐ　

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责任编辑　夏　娟