单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用

2010年11月

第19卷第4期中央民族大学学报（自然科学版）JournalofMUC（NaturalSciencesEdition）Nov.，2010Vol.19No.4

单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用

晋艺聪，洪帅，焦玉国

（中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081）

摘要：单细胞凝胶电泳又称彗星试验，是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂和碱性不稳定位点

的方法，具有敏感、稳定、快速的优点.近些年来，该方法广泛应用于遗传毒理、环境监测和细胞凋亡等的研

究.本文就彗星试验检测DNA损伤方法的原理，评价指标，影响因素以及在一些方面的具体应用进行了综述.

关键词：单细胞凝胶电泳；DNA损伤；原理；应用

文献标识码：A8036（2010）04-0017-05文章编号：1005-中图分类号：R394.6

人类生存的环境中有多种因子（如物理因子：电离辐射、紫外线、电磁辐射等；化学因子：氮氧化物、煤烟、汽车尾气等；生物因子：如细菌、病毒等）能够引起细胞的DNA损伤.DNA损伤是指由化学或物理因素引起的DNA链断裂、分子基体修饰和DNA交联等.如果这种损伤没有得到及时修复，就会引起突

乃至癌变.环境因子造成的DNA损伤可能会影响细胞的遗传稳定性，并可能对后代产生影响，例如变，

引起流产、死胎、畸胎和某些遗传性疾病.由于细胞的DNA损伤会造成疾病，威胁人类健康，因此对细胞

［1］DNA损伤进行检测，并了解这一损伤能否引起细胞事件的变化就显得十分重要.

用以直接或间接测定DNA链损伤的方法很多，以往常用技术如SOS/umu实验、微核实验（MN）和姐妹染色体交换实验（SCE）［2～3］.MN实验和SCE实验测试基因损伤时，细胞已经达到有丝分裂，甚至是分裂间期，染色体的后期修复已经开始发生.但是，近年发展起的单细胞凝胶电泳技术（SCGE）则可

而不需要等到有丝分裂之后才可以观测，因此是以在细胞水平上检验未修复DNA分子的单/双链损伤，

［4］一种更为敏感的DNA损伤检测手段，越来越得到关注.

1单细胞凝胶电泳技术的发展

20世纪70年代末Rydberg和Johanson最早报道直接定量检测单个细胞DNA损伤，将琼脂糖包被

靶细胞包埋于琼脂糖中，裂解细胞，在弱碱性条件下使DNA解螺旋，中和后以丫啶橙染色，于载玻片上，

用光度计测定绿色荧光（表明为双链DNA）与红色荧光（为单链DNA）强度，两者比值定量反映DNA损伤程度.该法由于条件要求严格，未能广泛应用［5］.

Ostling和Johanson又发展了微凝胶电泳技术，为改进方法的敏感性，细胞包埋于琼脂糖凝胶中，置

DNA断片从细胞核向阳极于显微玻片上，用高浓度的去污剂和盐裂解，然后在中性条件下短时间电泳，

DNA从而形成类似于彗星的尾巴，指向阳极，如果细胞中DNA损伤大，断片移行的距离也就长，移行，

的移行可用溴乙啶染色后用显微光度计测定.然而中性条件下裂解和电泳只能检测双链DNA断片（Double-strandedbreaks，DSBs），SSBs），不能测定单链断片（Single-strandedbreaks，而许多物质诱导的

［6］DNA单链断片数量比双链断片高5～2000倍，中性条件检测DNA损伤明显不如碱性条件下敏感.

05-08收稿日期：2010-

作者简介：晋艺聪（1987－），女（汉族），河南洛阳人，中央民族大学生命与环境科学学院环境科学专业硕士研究生在读，研究方向：环境化学.

18中央民族大学学报（自然科学版）第19卷

目前经常采用的方法是Singh等于1988年提出的碱性电泳方法.在碱性条件下，有助于DNA的变性和单链DNA断片的移行，此外碱性条件还可促使RNA降解，从而防止干扰，因而能够进行DNA单链损伤的检测，灵敏度大为提高［7］.

2单细胞凝胶电泳的原理及优点

真核细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏，使细胞内的DNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯有核DNA仍附着在剩余的核骨架上而留在原位.如果细胞未受损伤，电泳中核DNA停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象.若细胞受到损伤，在碱性电泳液（pH>13）中，DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾.细胞核DNA受损伤越严重，产生的断链或碱变性碎片就越多，片断也越小，电泳表现为彗星尾越长和彗尾越亮［8］.通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、亮度、出尾率等，判断细胞DNA有无受到损伤

［9］及损伤程度.与其他的遗传毒性检测实验相比，单细胞凝胶电泳具有以下优点：（1）灵敏度高；SCGE是评价遗

－15传毒性损害非常敏感的实验，可以检测到1.657×10中0.1个DNA的断裂，甚至检出自然光照射体

32外淋巴细胞1h后引起的DNA损伤，与姊妹染色体交换实验相比具有更高的敏感性，它与P标记后检

测的DNA加合物的灵敏度一致，被认为是低水平辐射（0.05Gy）致损伤检测的良好方法；（2）需要的样品量少；（3）应用范围广；（4）材料消耗少；（5）技术简单；（6）时间短；（7）可进行单细胞水平的原位检

使该技术能测；（8）具有多种检测功能.单细胞凝胶电泳最突出的优点是在单细胞水平测量DNA损伤，

够研究细胞群体内不同细胞的反应多相性（heterogeneity）.

3

3.1评价指标的确定单细胞凝胶电泳实验的评价指标及影响因素

彗星实验时，需要一个分析指标来表征DNA损伤.DNA损伤的分析指标有彗星出现率、尾长、尾部

［10～11］DNA荧光强度、.尾部面积、尾矩（TailMonment）与尾惯量（TailInertia）等

早期彗星实验多采用人工分析的方法进行DNA损伤评估，主要的分析指标是彗星长度参数和彗星出现率.Kne研究发现尾长只有在低剂量辐射作用下才与剂量成正相关，当损伤因素作用剂量增大时，DNA的损伤程度增加而尾长基本不变，因此，单纯用尾长作为分析指标不能很好地反映DNA损伤程度.1990年olive将图像分析系统引进到彗星实验中，以进行损伤分析，从而为能够进行正确、充分的彗星图像分析提供了可能［12］.

尾矩和尾惯量被认为是计算机软件分析系统中的较好指标，二者存在高度的相关性，它们的优点是使用一个指标即可反映DNA断裂频率（体现为彗星荧光强度）和遗传物质的迁移距离（体现为尾长）的

而在人工分析的过程中，肉眼无法区别图像中荧光强度大小.尾矩是头部中心到尾部重力中综合信息，

心的距离和尾部荧光强度百分比的乘积.但在分析中会出现尾长和尾部DNA含量不同的彗星其TM值却相同，这表明在进行单细胞凝胶电泳的图像分析时若单独采用TM值作为检测的指标是不够的.有些“彗星”TailLocal）组成，Henmna提出一种新的的尾部是由互不相连、大小不一的DNA断片（称为尾块，

［13～15］.尾惯量是一个与每一尾块的面积、分析参量TailInertia，认为它是对TailMomnet的良好补充平均

X轴上与彗核中心的距离有关的综合指标，荧光强度、可比尾矩提供更多关于尾部DNA断片分布的

信息.

3.2灵敏度的主要影响因素

影响单细胞凝胶电泳检测灵敏度的因素主要有以下几点：（1）低熔点琼脂糖的浓度；（2）细胞裂解液的组分；（3）电泳缓冲液的组分与pH值；（4）电泳条件，包括电压、电流强度和电泳时间，电泳时间与

第4期晋艺聪等：单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用19DNA迁移长度直接有关；（5）碱处理时间，适当延长处理时间可使DNA损伤表达增加，因此延长碱处理和电泳时间能够提高SCGE的灵敏性，能检出低剂量辐射造成的细微DNA损伤；（6）细胞所处周期的不同时相，因染色体的结构不同会影响DNA的图像形成.此外，彗星图像还与凝胶、染色剂、放大率及统计方法等因素有关；（7）DNA特异性的荧光染料；（8）图像的获取［16～19］.

4单细胞凝胶电泳的应用

SCGE是一种具有极高实用价值的、应用前景十分广阔的DNA损伤检测新技术.它所需样品量少，工作日程短，为现场人员调查和分析研究提供了可能；方法具有高度灵敏性；无需复杂的仪器设备，与图像分析系统联合应用，结果更精确，操作更方便，且无放射性示踪剂，既降低成本又减少对人体的危害.

SCGE技术已广泛应用于遗传毒适用范围广，凡能制成单细胞悬液的各种真核生物细胞均适用.因此，

细胞凋亡研究，环境监测等各个领域.理学，

4.1遗传毒理学

人体细胞无时无刻不暴露于各种有害物质中，导致DNA受损，然而人体可以修补破损的DNA并使

那么被破坏的细胞就不能恢复原状而恶变.细胞功能恢复正常；如果有某种物质影响DNA的修补工作，

SCGE可检测DNA切除修复缺陷与DNA交因而准确地测出各种物质对DNA修补的影响就更为重要，

氧化性损伤等多种类型的DNA损伤，故为探讨遗传毒性机理的有效工具.另外运用SCGE在活体进联、

行毒理学研究，还可了解药物遗传毒作用在不同组织和细胞中的分布［20］.

Speit使用SCGE研究表明当DNA链中一个修复通路受损害就可导致整个链的严重损伤［21］.当前，所有的检测方法都不能准确地测出某种物质对DNA修补的影响，彗星分析法是目前唯一能精确地测出DNA修复功能［22］，并及时发现致畸物质的方法.彗星分析法还可用来判别某种物质是否是毒性物质，并衡量其对人体DNA修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是有毒物质，那么DNA将被破坏，而被损坏的

［23］DNA将开始游离细胞核，.形成彗星形状

4.2细胞凋亡的研究

凋亡（Apoptosis）是人体自我保护的另一种功能，如果体内某一个细胞已经坏到无法修补的地步，凋

这些已损坏的细胞会继续复制，并扩散于全亡过程就开始进行.当损坏的细胞丧失应有的凋亡功能时，

身.研究表明，凋亡功能的丧失可能是导致某种癌症或其他病变的间接因素［24］.SCGE可以较其他方法

［25］更快速并准确地检测到已丧失凋亡功能的细胞，也可以提供细胞自杀过程的早期资料，这些优点使

此项测试法成为研究凋亡领域中的一项重要工具.凋亡细胞的DNA迁移距离数倍于正常细胞，甚至出“彗星”SCGE还可快速测定凋亡细胞的头尾分离的特有形态，其尾素值常高于30或60（正常<20），现

比例，有助于探讨凋亡机理

4.3［26～27］.彗星实验在环境污染监测中的应用

外界环境包括生活环境和生产环境.随着分子生物学技术的进展和普及，环境污染与DNA损害关

甚至导致癌变，日益引起人们的关注.外界环境中的理化因素对细胞DNA的损伤是引起基因突系密切，

变和癌变的主要原因，所以判断细胞DNA是否损伤是环境监测中重要的一环.利用彗星实验可以监测环境中存在的遗传毒性物质.

在生活环境方面：二氧化硫和飘尘是空气污染最主要的监测指标.程淑群等

剂量效应关系.张爱华等［29］［28］通过对生物固硫型煤和普通煤对实验动物生物学指标影响的对比研究，发现SO2能引起DNA损伤的增加，且存在一定的用SCGE法检测燃煤污染型砷中毒患者血细胞DNA的损伤作用时，发现燃

其损伤发生早于临床表现，并与尿砷、发砷呈正相关关系.煤中的砷能引起人体血细胞DNA单链断裂，

而且吸烟和氟的影响可加重砷对DNA的损伤作用.因此可将SCGE作为一种早期、实用的指标应用于

［30］.砷及SO2等接触人群的DNA损伤监测

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在生产环境方面：在生产过程中，能经常遇到各种影响劳动者身体健康的有毒物质.这些物质是否具有致癌性或致突变性，有许多文献用它们能否会引起DNA损伤进行初步估价.其中某些物质可直接

［31～32］.而另一些物质则需在体内经代谢活化后，引起DNA断裂，如H2O2、紫外线（UV）等方能产生致癌

性.王涛等［33］在加入体外活化系统的前提下，用彗星试验检测苯并（a）芘、黄曲霉毒素等9种间接致突

包括金属、非金属及其化合物以及有机化合物等.已有变物的DNA损伤.其中最常见的是化学性毒性，

多篇文献对用SCGE检测砷、汞、铅、铬、镍、氯乙烯等多种化学性毒物对DNA的损伤作了报道.

由此可见用SCGE检测DNA断裂在环境监测中的应用范围极其广泛，在某种程度上可以将它作为

它并不能评价每一种环境污染物的致环境污染物对健康影响的早期评价指标.同时此法也有它的局限，

SCGE就不能检测已有明显细胞毒性作用的Pb（NO3）2对DNA的癌/致突变性，如对常见工业毒物铅，

损伤［34］.因此，应结合其他指标和其他方法来判断该物质的致癌/致突变性.此外，目前我国由于经济条件限制，多数实验室对DNA损伤的彗星计数仍采用的是目镜测微尺，而不是采用图像自动分析仪，只能测定彗尾长度，而不能测量其亮度，因此对检测结果的准确性产生了影响.所以此技术还有改进的必要.

4.4群体生物学监测

彗星分析法和其他测试法的显著区别在于它使用的是健康的人体细胞来测试DNA的修补能力及

而其他方法使用的是患者的细胞，所以实验结果的准确性是不可争议的.还有，彗星分罹患疾病的几率，

析法与其他分析法最显著的区别是彗星分析法可以对DNA的破坏和自身修补进行定量的分析，也就是说，它能测出DNA被破坏的程度，而其他的测试法只能确定某一种物质是否会致病，而无法测出其损伤

［35］.另外SCGE具有简便、程度，更无法测出DNA修补的速度敏感、快速等优点，可检测大样本，已被用

于人群淋巴细胞对各种环境因素和化学物质致DNA损伤的敏感性筛选.

4.5临床诊断与治疗监测

SCGE可作为着色性干皮病（XP）和其他以切除修复缺陷为特征的综合征的诊断工具，有利于早期发现患者，控制疾病.SCGE也是目前唯一能检测人类实体肿瘤低含氧量细胞的放射生物学方法，已成

SCGE对肿瘤细胞亚群的治疗反应性及正常细胞个体功地应用于乳腺癌病人.在临床放疗化疗监测中，

［36］.的修复能力评价显示了SCGE对治疗的预测价值

5小结

彗星分析具有一系列的优点.如它可检测单个细胞的DNA损伤，这是其他方法不可替代的；操作简便快速，能很快得到结果；需要的细胞少，可用于多种细胞及组织的研究；方法极其灵敏，可用于各种与DNA链断裂有关的研究.因此，以彗星分析为手段进行的研究越来越多，使用该方法的实验室也越来越多.但也存在一些问题，一是进行彗星分析的实验室很多，但条件不尽相同，这就使得不同实验室的彗星分析结果可比性较差；二是彗星分析的参数较多，到目前还没有一个统一的指标.尽管如此，彗星分析因为其诸多的优点仍不失为一种测定单个细胞DNA损伤的好方法.

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