峨眉四照花茎尖组织培养技术_路承香

DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.04.095

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2008,36(4):1416-1418　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　理雪莲　责任校对　马君叶

峨眉四照花茎尖组织培养技术

路承香

1,2

,李仲芳

2＊

,王有科,孙飞达

13

(1.甘肃农业大学林学院,甘肃兰州730070;2.乐山师范学院化学与生命科学系,四川乐山614004;3.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州730070)

摘要　[目的]探讨峨眉四照花茎尖组织的最佳培养条件。[方法]采取峨眉山4～5年生四照花树体枝条的幼嫩茎尖作为外植体,研究不同生长激素对外植体诱导发育出丛生芽的影响。[结果]结果表明:培养基MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L组合对不定芽诱导效果较好。培养基MS+NAA0.5mg/L+6-BA2.0mg/L组合诱导茎尖产生大量愈伤组织。[结论]该研究为峨眉四照花的快速繁育、种质资源保存提供了技术依据和参考。关键词　峨眉四照花;组织培养;茎尖;愈伤组织中图分类号　Q943.1　　文献标识码　B　　文章编号　0517-6611(2008)04-01416-03PreliminaryDiscussiononTissueCultureTechnologyfortheStem-tipintheRareandProtectedPlantDendrobenthamiajaponicavar.emeinsisLUCheng-xiangetal　(CollegeofForestry,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070)Abstract　[Objective]Theaimoftheresearchwastodiscusstheoptimumcultureconditionsforthestem-tiptissueinDendrobenthamiajaponicavar.e-meinsis.[Method]Thetenderstem-tipsonthebranchesofD.japonicawith4～5yearsoldweretakenasexplantstostudytheeffectsofdifferentgrowthhormoneontheinductionanddevelopmentoftheclusteredbudsfromexplants.[Result]ThemediumcombinationsofMS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LIBAandMS+2.0mg/L6-BA+1.0mg/LIBAhadbetterinductioneffectsontheadventitiousbuds.Agreatdealofcalliwereproducedbyinducingstem-tipsinthemediumcombinationofMS+0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA.[Conclusion]TheresearchprovidedtechnicalbasisandreferencesfortherapidpropagationandgerplasmresourceconservationofD.japonica.Keywords　Dendrobenthamiajaponicavar.emeinsis.;Tissueculture,Stem-tip;Callus

　　峨眉四照花(Dendrobenthamiacapitatavar.emeinsisFangetHu.)隶属于山茱萸科,四照花属,别名石枣、山荔枝,落叶小乔木或灌木,高可达9m,产于长江流域诸省,多生长于海拔600～2000m的河谷、溪边及杂木林中,喜温暖湿润气候,有一定耐寒力,本种树形整齐,枝条疏散,树姿秀丽,夏赏玉花,秋观红果、红叶,是一种稀有的庭园观赏树种,也是一种珍稀保护植物。果实营养丰富,可鲜食,也可酿酒、制醋和入药,用途十分广泛[1]。目前对于四照花的研究主要集中在种质资源调查、常规栽培和繁育技术的研究上。吕寻等研究了四照花的栽培与管理技术[2]。韩维栋等对四照花鲜果的营养成分及其类群种质资源的开发利用作过调查[3]。易咏梅等进行了四照花种子萌发等方面的研究[4]。而有关峨眉四照花组织培养的研究未见报道。为此,笔者以峨眉四照花的茎尖作为外植体,探讨四照花有效的繁殖方法,试图为峨眉四照花的快速繁育、种质资源保存提供技术依据。1　材料与方法

1.1　试验材料　供试材料来源于四川省自然资源研究所峨眉山生物站(海拔990m,年平均气温22℃)。采4～5年生树体枝条的幼嫩茎尖,装入保鲜袋备用。采集时间分别为3月中旬,4、5月的上旬和下旬。1.2　试验方法

1.2.1　培养基。诱导愈伤组织及芽分化均选用MS培养基为基本培养基。在愈伤组织诱导培养基中附加不同浓度的6-BA及NAA进行对比试验;而在诱导芽分化的培养基中附加不同浓度的6BA、NAA及IBA,设MS+6-BA+NAA和MS+6-BA+IBA2种处理。每个处理中加蔗糖30g/L、琼脂7g/L,培养基pH值调至5.8左右。

1.2.2　外植体消毒与接种。将采集的材料先用自来水冲洗

基金项目　四川省教育厅重点项目(2006A128)。作者简介　路承香(1981-),女,甘肃靖远人,硕士研究生,研究方向:园

林花卉。＊通讯作者。

-干净,在超净工作台上用70%酒精消毒20s,再用0.1%升汞消毒5～8min,最后用无菌水清洗5遍。将灭完菌的外植体

用无菌滤纸吸干水分,切除茎尖以下较大叶片,切取茎尖接种于愈伤组织诱导培养基上。

1.2.3　培养条件。白天温度(24±1)℃,夜晚温度(21±1)℃,光照时数12h/d。采用的培养环境为GXZ智能型光照培养箱。

1.3　测定项目　外值体接种后每日观察,发现有污染、褐变的植株后详细记录并及时转接或清除,20d后开始观察外植体的生长状况。2　结果与分析

2.1　采集时间对峨嵋四照花茎尖组织培养的影响　从表1可以看出,外植体的采集时间对其成活具有很大的影响。3、4月为取材和接种的最佳时间,而5月采集的材料接种后几乎全部褐化。3、4月采集的茎尖颜色为嫩绿色,接种后发生轻微褐变,不影响植株的正常生长,随着培养时间的延长,褐变逐渐消失;而5月采集的幼嫩茎尖为浅红色或红色,到5月下旬有的已变为褐红色。5月上旬所采材料在接种后第2天就发生较严重褐变,此时及时转接并将基部切除,观察发现褐变减轻甚至无褐变现象发生。5月下旬所采材料在接种后2h基部已发红,随着时间延长,颜色越深,到第2天全部发生严重褐变。这说明随着气候的变化,气温的升高,四照花茎尖所分化的酚类物质可能增加,褐变率也随之增高[5]。2.2　愈伤组织的诱导　从表2可以看出,不同培养基对愈伤组织的诱导效果有明显差异。方差分析表明,MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L培养基的诱导效果与其他处理差异在0.05水平显著,对愈伤组织的诱导效果最好,外植体生长快,所形成的愈伤组织细密,数量大,愈伤组织数达到12个,诱导率达80.0%(图1);MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基对愈伤组织诱导效果最差,形成的愈伤组织松散,数量少,愈伤组织数仅为4个,诱导率仅为26.7%。同,,-,

36卷4期　　　　　　　　　　　　　　　　　路承香等　峨眉四照花茎尖组织培养技术1417

NAA浓度高有利于愈伤组织的形成;而相同的NAA浓度下,6-BA浓度高低对愈伤组织的形成没有直接关系。

表1　采集时间对峨嵋四照花茎尖组织培养的影响Table1　Effectsofdifferentsamplingtimeoncultureofexplants

采集时间Samplingtime月-日03-1604-1004-2205-0905-21

接种数No.ofinoculated

个

4650607275

褐化状况Browningsitutation

生长状况Growthstatus

污染率Contaminationrate%

　　　34.8

32.0

36.740.30

愈伤组织数No.ofcallus个

　　　33

32

3560

几乎无褐化Almostnobrowning生长良好Growthallright少量有轻微褐化Afewofexplantsbrowning生长良好Growthallrightslightly

有轻微褐化Browningslightly生长良好Growthallright褐化严重,仅有几株轻微褐化Browningsevere-几乎无生长Almostnogrowthly,justseveralassumedbrowningslightly全部褐化死亡Alltheexplantsbrowninganddeath

无生长Nogrowth

表2　不同培养基对愈伤组织诱导的影响

Table2　Effectsofdifferentculturemediumoncallusinduction

基本培养基Basicmedium

MS

MSMSMSMSMSMSMS

6-BA∥mg/L

2.01.00.50.53.02.03.01.0

NAA∥mg/L

0.50.50.50.20.50.20.20.2

接种数

愈伤组织数

诱导率Inductionrate∥%

80.0a

72.2b68.2b47.4c43.8c40.0c29.4d26.7d

No.ofinoculated∥个No.ofcallus∥个

15　　　　　　12

18221916151715

131597654

　注:表中数值均为平均值。采用LSD法进行方差检验,不同字母表示差异在0.05水平显著。下同。

　Note:Valuesinabovetablearemean,followedbyadifferentletterindicatesignificantlydifferentat0.05probabilitylevelaccordingtoLSDmethod.Thesameasbelow.

2.3　芽的分化　从表3可以看出,2种培养基配比所形成的芽增殖系数没有很大的变幅。

方差分析表明,MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L和MS+6-BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L处理之间差异不显著,而与其他处理差异在0.05水平显著,增殖系数分别达到3.35和3.41。由此得出,附加了IBA的6-BA2.0mg/L培养基中芽的分化较多,不定芽形成率较高,其中以MS+6-BA2.0mg/L+IBA

1.0mg/L培养基对四照花芽分化诱导效果最好(图2);而在附加生长素NAA的处理中,芽的分化率不高,MS+6-BA2.0

图1　愈伤组织诱导Fig.1　Inductionforcallus

mg/L+NAA0.5mg/L培养基的增殖系数最大,仅为1.53。可见,在峨嵋四照花的芽诱导分化中,IBA比NAA效果好

。

图2　有效芽分化

Fig.2　Differentiationofavailablebud

表3　不同培养基对芽分化的影响

Table3　Effectsofdifferentculturemediumonbudsdifferentiation

基本培养基Basicmedium

MSMSMSMSMSMSMSMS

6-BA∥mg/L

2.0

2.01.01.01.02.02.01.0

NAA∥mg/L　　　0

0000.50.20.50.2

IBA∥mg/L　　　1.0

0.51.00.50000

接种数

分化芽数differentiation∥个7567353223292321

增殖系数Proliferationcoefficient

3.41a3.35a1.94b1.52c1.35c1.45c1.53c1.11d

No.ofinoculated∥个No.ofbuds

2220182117201519

　/No.of

1418　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年

3　小结与讨论

峨眉四照花愈伤组织诱导培养基以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L最好,诱导率达80.0%;芽分化培养基以MS+6-BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L最好,且IBA比NAA效果好;最佳接种时间为树体萌芽后的最初1～2个月,即3～4月。在木本植物的组织培养中,褐变是普遍存在的一种现象。褐化是由于植物受伤后体内多酚氧化酶被激活,酚类物质氧化产生醌类物质而造成的。它们会逐渐扩散到培养基中,抑制其他酶活性,毒害整个外植体组织[6]。研究表明,随着峨嵋四照花的生长,萌芽后时间越长,组织培养中的褐化率越高,发生褐变的时间越短。

试验表明,峨嵋四照花丛生芽易诱导产生,但生长缓慢,易褐变及污染;愈伤组织易产生,但不易分化出不定芽,主要是由于供试材料为野外采集的材料,不易消毒。对于四照花(上接第1324页)

2　结果与分析

术后,所有施术牦牛精神状态、体温及饮食欲等皆正常。7d后检查,全部施术牦牛的瘤胃壁都与腹膜、腹肌及皮肤愈合在一起,形成自然瘘管,没有出现腹腔感染的征象。全部施术牦牛的瘤胃试验瘘管都保持到1.5年以上

。

的组织培养及培养基配方还处于摸索阶段,目前只能参考木本植物的组织培养[3]。就组织培养而言,四照花最适生根培养基的确定、组培苗移栽时间长短的确定、组培苗化学成分

的测定及其次生代谢产物的成分测定等都是当前工作的重点。参考文献

[1]蔡天军.色艳果佳的四照花[J].花卉,2007(9):11.[2]吕寻,赵精英.四照花的栽培与管理技术[J].特种经济动植物,2006,9

(6):38.[3]韩维栋.四照花类群种质资源及其开发利用[J].中国野生植物资源,

1993(1):37-40.

[4]易咏梅,郑洪,周建华.四照花和狭叶四照花种子的萌发试验[J].西部

林业科学,2004,33(4):17-19.[5]陈正华.木本植物组织培养及其应用[M].北京:高等教育出版社,1986.[6]周俊辉,周家容,曾浩森,等.园艺植物组织培养中褐变现象及抗褐研

究进展[J].园艺学报,2000,27(S):481-486.

术通路,故安装的瘘管结合牢固、不易滑脱、密闭性好,具有创口恢复快、无感染、简洁、实用、可靠等特点,明显优于传统的常规手术安置方法。

安放瘤胃试验瘘管时,皮肤及瘤胃切口一定要尽可能小,使皮肤和瘤胃紧紧箍于瘤胃试验瘘管上,这有助于防止瘤胃液外溢。皮肤切口宜靠近背部,尽量使瘤胃瘘管处于瘤胃的背囊顶部,以避免瘤胃内容物长时间浸泡切口和瘘管,减少瘤胃及腹壁切口术后感染的机会,以促进瘤胃壁、腹膜以及腹肌的愈合。

除个别性烈牦牛补注了全身麻醉药物外,其余皆采用局部麻醉方法,有效降低了手术的危险性,保证了施术动物的安全。参考文献

[1]候振中,徐永发.绵羊人造瘤胃瘘管的手术体会[J].黑龙江畜牧兽医,

2001(9):24.[2]曹杰,王

春.大口径牛瘤胃瘘管手术新方法[J].畜牧与兽医,2006,38

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牧兽医,2006(7):62.[4]王玲,赵胜军,苏鹏程,等.羊消化道永久性瘘管手术方法的改进[J].

宁夏农学院学报,2004,25(3):36-37.[5]赵艳兵,黄海龙,白景煌,等.用双切口法造牛瘤胃永久性实验瘘管

[J].中国兽医科技,1999,29(3):31.[6]刘焕奇,邵春兰,刘东明,等.山羊人造瘤胃瘘管术改进的几点体会

[J].畜牧与兽医,2005,37(1):43.[7]陈金山,宋百军.狍实验性瘤胃瘘管手术[J].中国兽医杂志,2005,41

(5):13-14.[8]王星凌,李兴光,宋恩亮.大口径牛瘤胃瘘管的安装与应用[J].山东农

业科学,1999(1):48-49.

图2　装置完毕后的外观示意图

Fig.2　Theappearancesketchafterdevicesfixed

3　小结与讨论

牦牛体型小,手术操作简便。术后恢复快,护理简单,瘘管安装后1周即可进行试验。因瘘管部位的腹部肌肉张力较大,对于常规手术安置方法,若缝合不牢固,容易导致瘘管脱落,引起胃液外流,造成瘘管周围组织溃烂和长期化脓,进而会导致瘘管松动滑脱难以固定,从而改变试验牦牛的瘤胃内环境,影响试验结果。该方法无须缝合固定瘤胃及其创口,也无须荷包缝合安置好的瘘管,只需常规闭合手