高氧致早产鼠AECⅡ凋亡及其信号机制

第７卷第２期

二００５年４月

中国当代儿科杂志

Ｃｈｉｎ

Ｖ０１．７Ｎ０．２Ａｐｒ．２００５

ＪＣｏｎｔｅｍｐｐｅｄｉａｔｒ

?实验研究?

高氧致早产鼠ＡＥＣⅡ凋亡及其信号机制

李冬梅１，薛辛东１，闰丽娟２，张宏伟２，郑菲２，南春红２，岳志军２

（１．中国医科大学附属第二医院儿科，辽宁沈阳１１０００４；２．辽宁中医学院，辽宁沈阳１１００３２）［摘要］

目的吸人高浓度氧气是导致新生早产儿肺发育障碍，并最终发展为慢性肺疾病（ｃＬＤ）的主要原

因，但其详细机制尚不清楚。本文旨在确定肺泡Ⅱ型上皮细胞（ＡＥＣⅡ）凋亡在高氧诱导的早产鼠ｃＬＤ形成中的作用及其主要信号机制。方法９３只新生早产大鼠随机分为两组：对照组（凡＝４５）吸入空气，模型组（ｎ＝４８）吸入≥９５％氧气。分别采用原位末端标记技术（ＴｕＮＥＬ）、电镜及逆转录聚合酶链反应（ＲＴ—ＰｃＲ）技术检测特定时间点各组大鼠肺组织细胞凋亡及其相关因子的表达。结果模型组凋亡指数（ＡＩ）自７ｄ起明显高于对照组（Ｐ＜０．０５），发生凋亡的细胞是ＡＥｃⅡ；模型组Ｂａ】【ｍＲＮＡ

３

ｄ起高于对照组（Ｐ＜０．０５），Ｂｃｌ－２自７ｄ起低于对照组（Ｐ

＜０．０５）；两组ＦａｓｍＲＮＡ表达无差异（Ｐ＞０．０５）。结论早产大鼠ｃＬＤ过程中存在ＡＥｃⅡ凋亡，这可能是导致高氧诱导的ｃＬＤ早产大鼠肺泡发育障碍的主要因素之一；凋亡信号的启动可能有Ｂａｘ与Ｂｃｌ．２比值变化的参与，而与Ｆａｓ的转录表达无关。

［关键词］慢性肺疾病；Ｂａｘ蛋白；早产；大鼠［中图分类号］

Ｒ－３３

［中国当代儿科杂志，２∞５，７（２）：１５４—１５８］

［文献标识码］

Ａ

［文章编号］１００８—８８３０（２００５）０２—０１５４—０５

Ｈｙｐｅｒｏｘｉａ?ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＡＥＣⅡｉｎｐｒｅｍａｔｕｒｅｒａｔｓａｎｄｉｔｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ

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ａｐ叩ｔｏｓｉｓ，ｗｈｉｌｅＦａｓｔｍｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍａｙｂｅｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ．［ｃｌｌｉｎＪｃｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ，２００５，７（２）：１５４－１５８］

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｈｒｏｎｉｃｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ；Ｂａｘｐｍｔｅｉｎ；Ｐｒｎｌａｔｕｒｅｂｉｎｈ；Ｒａｔ

新生儿慢性肺疾病（ｃｈｒｏｎｉｃ

ｌｕｎｇ

ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＬＤ）但是已经有实验证实高氧在体内外均能引起肺泡Ⅱ型上皮细胞（ａｌｖｅｏｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｙｐｅⅡｃｅｌｌ，ＡＥＣⅡ）

凋亡旧，３Ｊ。ＡＥＣⅡ是肺内表面活性物质合成的场所，

与早产密切相关，是新生儿监护病房内最严重也是最棘手的临床问题。目前认为吸入高浓度氧气是引起ｃＬＤ最主要的原因，肺发育障碍是ｃＬＤ的主要病理形态学改变¨１。

凋亡参与了机体许多重要的病理生理过程。虽然目前还没有关于凋亡是否参与ｃＬＤ形成的证据，

并能按需求增殖并分化为肺泡Ｉ型上皮细胞，在肺的生长、发育、损伤及修复过程中发挥重要作用。探索早产儿ｃＬＤ过程中ＡＥｃⅡ凋亡的规律及其调控机制，不仅可以完善ＣＬＤ肺泡发育障碍的发生机

［收稿日期］２００５一０１．０８；［修回日期］２００５－０２．２４

［基金项目］国家自然科学基金（编号３０４４００５６），辽宁省自然科学基金（编号２００２２０７１），辽宁省教育厅攻关计划（编号２０２０１３１２７）［作者简介］李冬梅（１９７３一），女，博士研究生，主治医师。主攻方向：新生儿专业。

［通讯作者］薛辛东，中国医科大学附属第二医院儿科，邮编１１０００４。

?１５４?

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中国当代儿科杂志

Ｃｈｉｎ

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ＪＣｏｒｌｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ

制，并可为寻求新的防治途径提供理论依据和奠定实验基础。本研究以高氧致早产鼠ｃＬＤ模型为对象，动态观察肺内细胞凋亡及ＡＥＣⅡ的超微结构变化，并同时研究Ｂａｘ、Ｂｃｌ．２及Ｆａｓ基因表达的动态变化，旨在探讨ＡＥＣⅡ凋亡在ＣＬＤ过程中的作用及其信号机制。

１．２．５原位细胞凋亡检测采用原位末端标记

技术（ＴｕＮＥＬ）技术，随机选取３个视野，光镜下（×４００）计数５００个细胞内凋亡细胞数，计算凋亡指数

（ａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ，ＡＩ，ＡＩ＝凋亡细胞数／细胞总数×１００％）。

１．２．６细胞超微结构观察

（×８０００）。

１．２．７

铀铅双重染色，透射

电镜（ＪＥＭ．１２００Ｅｘ８０Ｋｖ）下观察ＡＥＣⅡ超微结构

１材料与方法

１．１试剂

原位细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；ＲＮＡ提取液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）试剂盒及所需引物（Ｔａｋａｒａ大连生物工程公司）。

１．２方法

Ｉ．２．１

肺组织Ｂａｘ、Ｂｃｌ．２、ＦａｓｍＲＮＡ表达：采用

Ａ一３’，下游：５’一ＡＧＧ

ＡＣＴ

ＲＴ．ＰＣＲ方法。ＰＣＲ扩增引物：Ｂａｘ上游：５’一ＴＧＣ

ＴＡＣＡＧＧ（疆ＴＩ＇ＴＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧ

Ａ．３’（共３５２ｂｐ）；Ｂｃｌ－２上游：

ＴＣＧ＿３’，下游：５

７一

５’．ＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡ

ＣＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡ

ＡＣＣ一３’（共２３７ｂｐ）；

Ｆａｓ上游：５

７．ＡＣｃＴＣＣＡＧＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣ一３

ＧＣＡＧＴＣＣＣＴ一３

ＡＣＣ

７，下游

实验对象及分组２０只妊娠２ｌｄ的ＳＤ

５７．ＡＴＡＡＣＡＧＡＡ

７（共６４７ｂｐ）；

７（共

大鼠（由陆军总院实验动物中心提供，足月为２２ｄ），经剖宫产获得仔鼠１６０只，迅速复苏（存活率５８％）后转交与代母鼠喂养，随机分为两组，对照组：ｎ＝４５，平均体重４．７６±０．０８ｇ；模型组：ｎ＝４８，平均体

重４．７３±Ｏ．０７

ｇ。

ＧＡＰＤＨ上游：５’一ＴＣＣ

３

ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ－

７，下游：５‘一ＡＣＣ

ＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ一３

５２８

ｂｐ）。以ＧＡＰＤＨ为内参照，灰度值半定量分析。

应用ｓＰｓｓ１１．５统计软件进行统计学处理，数

１．３统计学分析

１．２．２动物模型的建立模型组仔鼠连同代母据以ｉ±ｓ表示，单因素多水平比较采用方差分析，两组问比较采用￡检验，相关分析采用Ｓｐｅａｍａｎ分析。Ｐ＜０．０５为差异有显著性。

２

鼠置密闭透明氧箱内，持续给予纯氧，保持氧箱内氧气浓度≥９５％ＨＪ，每天定时开箱３０ｍｉｎ添加食水，更换垫料，与对照组交换代母鼠；对照组置空气中饲养。

１．２．３

标本采集每组分别于实验开始后的１结果

高氧诱导的ＣＬＤ早产大鼠肺组织病理改变

ｄ、３ｄ、７ｄ、１４

ｄ和２１ｄ随机选取５只鼠，称重，１０％

２．１

水合氯醛腹腔麻醉，无菌取完整肺组织，左肺以４％多聚甲醛（１‰ＤＥＰｃ）固定，常规制备石蜡切片，右肺上叶以２．５％戊二醛固定制备电镜超薄切片，其余肺组织置Ｅｐｐｏｎｄｏｒｆ管（ＲｎａｓｅＦｒｅｅ）内一８０℃保存。实验过程中非取材原因死亡的仔鼠（对照组自然死亡４只，模型组因高氧等多种原因死亡１９只）

及２１ｄ实验结束后仍存活的仔鼠（对照组１６只，模

２．１．１组织学改变对照组出生后肺泡上皮自

不规则结构逐渐发育成熟，至２１ｄ肺泡结构规整，肺泡大小均匀一致，肺泡间隔变薄（图１Ａ）。模型

组３ｄ肺间质炎性细胞浸润；７ｄ肺泡腔变大，间隔变

薄；１４ｄ肺泡融合，数量减少；２１ｄ正常肺泡结构消失，大面积肺泡融合，大量肺间质细胞增生（图１Ｂ）。

２．１．２

型组４只）均被剔除，不记入实验结果统计之内。１．２．４肺组织病理观察

ａｌｖｅｏｌａｒ

ＲＡＣ变化

吸氧１ｄ和３ｄ，两组ＲＡＣ无

ｄＰ

常规苏木素一伊红染差异（Ｐ＞０．０５），７ｄ起模型组低于对照组（７

＝ｏ．０１３，１４、２１

色，光镜下观察（×４００），放射性肺泡计数（ｒａｄｉｃａｌ

ｃｏｕｎｔ，ＲＡｃ，从呼气性细支气管中心至远端

胸膜引一垂直线，计数该直线上的肺泡数量）。

ｄ

Ｐ＜０．００１），并持续下降（Ｆ＝

１８．１７１，Ｐ＝ｏ．００１），至２１天降至最低，不及Ａ组的

一半（表１）。

（石±ｓ，ｎ＝５）

表１对照组和模型组ＲＡＣ的比较

“

与对照组比较ａＰ＜Ｏ．０５，ｂＰ＜０．００１

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第拟７巧

餐２月

期中国当代儿科杂志

Ｃｈｉｎ

Ｖ０１．７Ｎｏ．２Ａｐｒ．２００５

ＪＣｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ

图ｌ高氧诱导的ＣＬＤ早产大鼠肺组织病理改变（１Ⅲ×４∞）

Ａ对照组２１ｄ肺泡结构规整，肺泡大小均匀一致，肺泡间隔变薄。Ｂ模型组２１ｄ正常肺泡结构消失，大面积肺泡融合，大量肺间质细胞增生。

２．２高氧诱导的ＣＬＤ早产大鼠ＡＥＣⅡ凋亡

２．２．１

组高于对照组（７

ｄ

Ｐ＝０．００４，１４ｄ、２１

ｄＰ＜

ＡＩ的变化两组ＡＩ在吸氧１、３ｄ时没

Ｐ＝０．０６７），７ｄ起模型

ｏ．００１），并随着吸氧时间的延长逐渐升高（Ｆ＝

１３８．２８４，Ｐ＜Ｏ．００１），２１ｄ达最大值（图２Ａ，表２）。

有差异（１

ｄＰ＝０．７３８，３ｄ

表２对照组和模型组ＡＩ的比较（茗±ｓ，ｎ＝５）

与对照组比较ｂＰ＜Ｏ．００１，ｃＰ＜０．０１

图２

Ａ模型组２１

ｄ

高氧诱导的ＣＬＤ早产大鼠ＡＥＣＩＩ凋亡改变（Ａ×４∞；Ｂ，Ｃ×８∞０）

ＴｕＮＥＬ检测结果。Ｂ电镜下模型组ＡＥＣⅡ７ｄ开始出现凋亡的特征性改变，即：微绒毛减少，染色质浓缩，

沿着核膜排列，形成不同形状和大小的块状。ｃ电镜下模型组ＡＥｃⅡ２ｌｄ时细胞核固缩、融解，线粒体、微绒毛消失，板层小体完全排空，肺间质有大量纤维组织增生。

２．２．２

ＡＩ与ＲＡＣ的相关性电镜结果

模型组ＡＩ与ＲＡＣ膜排列，形成不同形状和大小的块状（图２Ｂ）。

１４

变化呈负相关（ｒ＝．０．４６６，Ｐ＝０．０２）。

２．２．３

ｄ上述变化明显加重，并伴有气血屏障明显增厚；

对照组ＡＥＣⅡ表面微绒毛至２１ｄ时细胞核固缩、融解，线粒体、微绒毛消失，

（ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ，Ｍｖ）完整，胞浆内可见线粒体（ｍｉｔｏｃｈｏｎ—ｄｒｉａ，Ｍｉ）和板层小体（１ａｍｅｌｌａｒｂｏｄｉｅｓ，ＬＢ），质膜连续完整，气血屏障正常完整，肺问质内无胶原沉积。模

型组吸氧１ｄ，ＡＥＣⅡ中可见少量线粒体肿胀；３ｄ开

板层小体完全排空，肺问质有大量纤维组织增生

（图２Ｃ）。

２．３

高氧诱导的ＣＬＤ早产大鼠肺内Ｂａｘ、Ｂｃｌ＿２、

ＦａｓｍＲＮＡ表达变化

２．３．１

始出现板层小体排空；７ｄ除上述改变外，出现凋亡的特征性改变，即：微绒毛减少，染色质浓缩，沿着核

ＢａＸ与Ｂｃｌ一２表达变化实验ｌｄ两组肺

组织Ｂａｘ表达强度无差异（Ｐ＞０．０５），３ｄ以后模型

?１５６?

第７卷第２期中国当代儿科杂志Ｖ０１．７Ｎｏ．２２００５年４月ＣｈｉｎＪＣｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａ”Ａｐｒ２００５组高于对照组（３ｄＰ＝Ｏ．０２；７ｄＰ＝０．００１，１４、２１ｄ模型组ＢａＸ与Ｂｃｌ一２的比值（ＢａＸ／Ｂｃｌ－２）自３ｄＰ＜Ｄ．ＤＤＪ），并随着吸氧时间的延长逐渐升高（Ｆ＝起高于对照组（３ｄＰ＝０．００３，７，１４，２ｌｄＰ＜２７．６８５，Ｐ＜０．００１），２１ｄ最高（图３Ａ，表３）。实验．ｏ．００１），并持续升高（Ｆ＝８６．７９２，Ｐ＜０．００１），至１、３ｄ两组肺组织Ｂｃｌ．２表达强度无差异（Ｐ＞２１ｄ达峰值。

０．０５），７ｄ以后模型组低于对照组（７ｄＰ＝０．０４７，２．３．２Ｂ彬Ｂｃｌ一２与ＡＩ相关性分析模型组１４、２１ｄＰ＜０．００１），并随着吸氧时间的延长逐渐降ＢａＸ／Ｂｃｌ－２与ＡＩ呈正相关（１＝０．５１１，Ｐ＝０．００５）。低（Ｆ＝３８．４９９，Ｐ＜０．００１），２１ｄ最低（图３Ｂ，表２．３．３Ｆａｓ表达变化两组各个时间点Ｆａｓ表达３）。无显著性差异（Ｐ＞０．０５）（表４）。

表３对照组和模型组Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达的比较（ｉ±ｓ，ｎ＝５）

与对照组比较，ａＰ＜０．０５，ｂＰ＜０．００１，ｃＪＰ＜０．０ｌ

图３高氧诱导的ＣＬＤ早产大鼠肺内Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达变化

Ａ两组肺组织ＢａｘｍＲＮＡ表达。Ｂ两组肺组织Ｂｃｌ一２ｍＲＮＡ表达。（１：Ｍａｒｋｅｒ，２～６：分别为对照组ｌｄ，３ｄ，７ｄ，１４ｄ，２１ｄ；７～１１：分别为模型组１ｄ，３ｄ，７ｄ，１４ｄ，２ｌｄ）。

表４对照组和模型组Ｆ嬲ｍＲＮＡ表达的比较（≥±ｓ，ｎ＝５）

机制还不十分清楚。

３讨论近期体内外研究提示凋亡可能在肺泡上皮损伤

的病理过程中发挥重要作用。发生肺损伤的人肺泡

合并有心肺疾病的早产儿接受高浓度氧气和机上皮细胞出现了凋亡的特征性改变＂Ｊ，及凋亡特异械通气治疗，发生ｃＬＤ的危险增加。近期报道证实蛋白ＢａＸ表达的增加¨１。经９０％高氧处理４８ｈ的肺发育不足是ｃＬＤ的主要病理形态学改变¨’４ｏ。当成年大鼠ＡＥｃⅡ，在体外表现出明显的凋亡信号及损伤干扰了肺泡发育的关键过程一肺泡上皮细胞的ＤＮＡ损伤一Ｊ。９５％高氧能引起体外培养的胚胎大增殖和分化，使受损肺泡上皮不能得到充分的修复鼠ＡＥｃⅡ大量凋亡∞Ｊ。Ｍｃｇｒａｔｈ—Ｍｏｒｒｏｗ等”１发现高就会进一步引起ｃＬＤ的发生∞１。目前，肺发育异常浓度氧能引起新生的足月小鼠肺内凋亡信号的增已经成为国际上关于ｃＬＤ研究的新焦点，但其主要　加，并与氧作用时间成正比∞ｏ。其他研究者在成年

?１５７?

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ＪＣｏｎｔｅｍｐＰｅｄｉａｔｒ

鼠肺内也观察到了类似的结果∞’１０Ｊ。因此有人认为凋亡可能是高浓度氧在肺发育关键阶段引起肺的生长和重塑异常的重要因素。本研究也显示在ＣＬＤ形成过程中ＡＩ明显升高，而且ＡＩ与ＲＡＣ的变化呈负相关。出现凋亡特征性改变的细胞是ＡＥＣＩＩ，并随着吸氧时间的延长而逐渐加重。凋亡可能是机体对高氧刺激的一种应激反应，通过这种方式清除受损后不能恢复的细胞，维持机体内环境的稳定，限制炎症反应。然而肺发育成熟主要发生在出生前后，在这个关键时期由于高氧的影响ＡＥＣＩＩ凋亡数量过多，使肺泡不能维持正常的形态结构，从而影响了肺泡的发育成熟。本研究提示ＡＥｃＩＩ的凋亡参与了ｃＬＤ的发生、发展过程，这可能是导致高氧致ＣＬＤ早产大鼠肺泡发育障碍的主要原因之一。

［６］［５］［４］

［３］［２］

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ＧａｖｉｎｏＲ，ＪｏｈｎｓｏｎＬ，ＢｈａＩｌｄａｄＶ．Ｒｅｌｅａｓｅｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓａｎｄ

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Ｍ，ｗａｔｋｉｎｓＳＣ，ＬｕＹ，

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已有研究证实在高氧性肺损伤过程中，Ｂ彬

Ｂｃｌ－２的变化是导致肺细胞凋亡决定性的关键∞川。本研究中，在高氧诱导的新生早产大鼠ｃＬＤ损伤过程中ＢａｘｍＲＮＡ在吸氧３ｄ时升高，而Ｂｃｌ．２在７

ｄ

［８］［７］

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ｄｙｓｐｌａｓｉａ［Ｊ］．ＡｍＲｅｓｐｉｒｃｒｉｔｃａｒｅＭｅｄ，２００２，１６５

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ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ｉｎ

降低，进而导致Ｂ彬Ｂｃｌ－２持续升高并且与ＡＩ的变

化呈正相关，提示Ｂａｘ与Ｂｃｌ－２比值的变化可能参与了高氧诱导的ｃＬＤ早产鼠ＡＥｃⅡ凋亡的线粒体

途径的启动。

［９］

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ＷａｒｂｕｎｏｎＤ．ＡｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄＤＮＡｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆ南ｍ２７４（５

Ｐｔ

近期的证据提示通过Ｆａｓ表达上调介导的过度凋亡是肺损伤与纤维化的主要病理机制之一¨２｜。体外实验也发现Ｆａｓ配体能引起ＡＥｃＩＩ源的培养细胞凋亡¨３｜。但是Ａｏｓｈｊｂａ等¨４ｏ的研究得出了相反的结论，即：Ｆａｓ系统不是博莱霉素引起的小鼠肺组织内细胞凋亡的必须途径。而且在高氧引起的Ａ５４９培养细胞凋亡过程中没有出现Ｆａｓ途径的下游信号一ｃａｓｐａｓｅ８的变化¨５｜。与本研究结果一致。这说明Ｆａｓ的转录表达可能没有参与介导高氧致早产大鼠ＣＬＤ过程中肺细胞的凋亡。

综上所述，本研究提示ＡＥＣＩＩ的凋亡可能参与了ｃＬＤ的发生、发展过程，并可能是高氧致早产大鼠ｃＬＤ肺泡发育障碍的主要因素之一。在ｃＬＤ过程中Ｂａｘ与Ｂｃｌ．２比值的变化可能参与了凋亡信号的启动，而传统的凋亡诱导基因Ｆａｓ的转录表达可能与此无关。

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（本文编辑：王霞）

［１］

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