酶法水解燕麦多肽特性的研究

酶法水解燕麦多肽特性的研究

张晓斌

（国家脂肪酸技术研究推广中心，安徽宿州234023）

要：研究蛋白酶水解工艺制备燕麦多肽，对燕麦多肽体积排阻进行高效液相色谱（SE－HPLC）

分析，测定燕麦多肽的疏水性和溶解性，研究结果显示碱性蛋白酶对燕麦蛋白有较好的水解作用，当未用风味酶水解时，燕麦多肽的平均疏水性为105．43kj/mol残基，当DH为16．86%时，溶解度达到了100%，并对燕麦多肽脱苦进行研究，测定燕麦多肽的分子量分布，燕麦多肽的相对分子质量分布范围在142～21281Da之间，主要集中在142～1413Da之间。摘

关键词：燕麦；蛋白酶；多肽；水解；疏水性；溶解性

中图分类号：TS210．1文献标识码：A文章编号：1007－7561（2012）01－0016－03

Researchonthecharacteristicsofoatpolypeptidebyenzymatichydrolysis

ZHANGXiao－bin

（NationalFattyacidTechnologyResearchPromotionCenter，SuzhouAnhui234023）

Abstract：Thetechniqueofprocessingoatpolypeptidebyproteasehydrolysiswasstudied．Theoatpoly-peptidewasanalyzedbysizeexclusionhighperformanceliquidchromatography（SE－HPLC）．Thehy-drophobicpropertyandsolubilityofoatpolypeptidewasdetermined．Theresultsshowedthatalkaliprote-asehasgoodhydrolyzationonoatprotein．Theaveragehydrophobicpropertyofoatpolypeptidewas105．43kj/molresidueswithoutflavorases．Thesolubilityachieved100%when16．86%DH．Debitter-izingofoatpolypeptidewasalsostudiedanditsmolecularweightdistributionwasdetermined．Therela-tivemolecularmassdistributionwasaround142～21281Da，mainlyin142～1413Da．Keywords：oat；protease；polypeptide；hydrolysis；hydrophobicproperty；solubility燕麦具有特殊的营养、保健功能，有较好的开发前景料

［2］

［1］

的特性，利用燕麦进行深加工，生产高附加值产品，具有广阔的市场前景，必定会带来极为可观的经济效益和社会效益。

。我国燕麦主要作为部分食粮和家畜饲

，燕麦籽粒中蛋白质含量丰富，因品种不同可

达13%～20%，甚至更高，含量在谷物中居于首位。燕麦中蛋白质的组成不同于其他谷物蛋白，醇溶蛋白仅占总蛋白的10%～15%，谷蛋白约占20%～25%，而清蛋白和球蛋白约占60%～70%。燕麦中的蛋白质是谷物中平衡最好的，燕麦蛋白质中的必须氨基酸组成较平衡，各种必须氨基酸含量均高于或接近FAO/WHO颁发的氨基酸标准模式值。

燕麦是谷类食品中最好的全价营养食品之一

［3］

1

1．1

材料与方法

实验材料

燕麦粉由山西燕麦研究所提供，蛋白酶和淀粉

8－苯氨基酶购于NovoNordisk公司（北京分公司），

－1－萘磺酸盐（ANS）购于东京化学工业株式会社，其他化学试剂为分析纯。1．2

主要仪器

冷冻离心机20PR－52D：日本HITACHI公司；超级恒温水浴器CS501：重庆试验设备厂；PHS－2C型精密酸度计：上海雷磁仪器厂；冷冻干燥ALPHA1－4/2－4：德国CHRIST公司；ZFA－1型旋转蒸发仪：上海玻璃仪器二厂；HB－Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸公司。1．3

实验方法

蛋白质含量的测定

半微量凯氏定氮法

1．3．1

，近年来，国内外对其进行了较广泛的开

发。

［4－5］

燕麦的营养特性充分证明燕麦是一种极具开发潜力的粮食经济作物。本文研究酶法水解燕麦多肽

收稿日期：2011－05－23

作者简介：张晓斌（1975－），男，安徽宿州人，副研究员．

肽含量。

蛋白质溶解度（%）=上清液蛋白质或多肽（g）/蛋白质样品（g）×100。

（GB5511—85），转换系数采用5．83。1．3．21．3．31．3．4式：

DH=B×Nb×1/α×1/MP×1/htot×100%，Nb—碱液的浓度其中：B—碱液体积（mL），

（mol/L）；α—α－氨基的解离度，MP─底物中蛋白质总量（g）；htot─底物中蛋白质肽键总数（mmol/g蛋白htot=8．4mmol/g蛋白。质）；对燕麦蛋白而言，1．3．5多肽。

提取：将燕麦蛋白置于去离子水中，控制不同的DH。

离心：5000r/min下离心20min。干燥：采用喷雾或冷冻干燥。1．3．6

燕麦多肽体积排阻高效液相色谱（SE－

高效液相色谱仪：Waters600（配2487

HPLC）分析

燕麦多肽制备工艺流程

燕麦蛋白→蛋白

酶水解→灭酶→离心→上清液→浓缩→干燥→燕麦

水分的测定105℃恒重法（GB5512—85）。灰份的测定高温灼烧法（GB12086—1989）。酶解蛋白质水解度（DH）的测定

在中性

2

2．1

结果和讨论

不同蛋白酶对燕麦蛋白的水解能力

从图1中可以看出，碱性蛋白酶对燕麦蛋白有

及碱性条件下采用pH－stat法，水解度的计算公

较好的水解作用，远比其他几种蛋白酶的水解作用强。其次是复合蛋白酶，虽然风味酶的作用范围广，但在此条件下对燕麦蛋白作用较弱，复合蛋白酶对燕麦蛋白的作用稍强可能是前者纯度和活性较高或对底物的特殊要求不同而造成。中性蛋白酶对燕麦蛋白的作用较弱，作用250min的DH只有2．0%左右。由于碱性蛋白酶的价格较便宜，对燕麦蛋白的因此采用碱性蛋白酶水解燕麦蛋白来水解作用强，制备燕麦多肽

。

紫外检测器和M32工作站）；色谱柱：TskgelG2000SW×L相对分子质量分级范围100～10000Da；流动相：乙晴/水/TFA45/55/0．1；检测波长：220nm；流速：0．5mL/min；柱温：30℃。1．3．7

疏水性的测定

以ANS为探针，这种试剂

2．2

但在水或非极性环境中在非极性环境中产生荧光，

没有荧光。ANS与蛋白质中的膜或相对疏水的区域键合时，就会发生荧光，利用这个特性就可以检测蛋白质的表面疏水性。

配制1mg/mL的蛋白溶液，溶于0．01M的磷酸缓冲液中（pH7．0），在20℃下处理2h，于10000r/min下离心10min，测定上清液中的蛋白质0．075、浓度。得到的上清液分别稀释到0．15、0．038和0．019mg/mL，在4mL的蛋白液中加入20μL的ANS，测定荧光强度，发射光和激发光的波长分别为390nm和470nm，以荧光强度对蛋白浓度做出曲线，将曲线的开始斜率定为被检测样品的表面疏水性S0。

ANS溶液的配制：8mMANS溶于0．01M的磷pH值为7．0。酸缓冲液中，1．3．8

溶解性的测定

将2g燕麦蛋白或多肽加

入100mL水中，用0．1mol/L盐酸和0．1mol/L氢室温下1000r/min搅拌1氧化钠溶液调节pH值，

h，3000r/min离心20min，测上清液中蛋白质或多

图1

几种蛋白酶水解燕麦蛋白的进程曲线

不同DH对燕麦多肽溶解性的影响

对于特定的酶和底物，任何反应进程都涉及到

S］，E］/五个独立的变量，即底物浓度［酶跟底物比［［S］，pH值，温度T和作用时间t。如果就五个独立变量对水解反应的影响进行系统试验研究，将不得不进行数目难以接受的试验。目前，一般采用DHDH即蛋白质在水解进程来控制酶解反应的进行，

中，打断的肽键占蛋白质总肽键的百分数。根据酶［S］、［E］/［S］水解的动力学，和T的改变通常只会引起反应速度的改变，在特定的pH值条件下，水解反应的最终结果只与DH有关，而要达到这一结果，S］、［E］/［S］、T和t。因此实验采可以有不同的［

用溶解性为指标，通过DH的变化对溶解性的影响来确定燕麦多肽的制备。

由表1可以看出，燕麦蛋白在pH7的水中溶解度为57．25%，溶解性较差，随着水解的进行，溶解度逐渐增大。当DH为4．37%时，溶解度达到了60．26%，说明有部分燕麦蛋白被水解成燕麦多肽，当DH为16．86%时，溶解度达到了100%，说明此时的燕麦多肽能全部溶于pH值为7的水中。因此

粮食工程

选择DH16．86%为碱性蛋白酶的水解终点。

表1DH/%04．376．779．2511．4012．2316．86

不同DH对燕麦多肽溶解性的影响

溶解度/%57．2560．2666．6378．8684．8295．31100

表3

时间/min

015306090120

粮油食品科技第20卷2012年第1期

不同时间对风味酶脱苦的影响

平均疏水性/（kj/mol残基）

105．4367．4620．187．895．064．92

在上述最适条件下，对脱苦后的燕麦多肽进行燕麦多肽的得率为65．6%，纯度为83．46%。制备，

对所制备的燕麦多肽的相对分子质量分布和溶解性进行分析，结果见图2～图3

。

2．3燕麦多肽的脱苦

研究表明，随着蛋白质DH的增加，原本掩蔽在

天然蛋白质内部的疏水性氨基酸会暴露出来，导致对底物有特异苦味生成。蛋白酶在水解蛋白质时，

性要求，所以不同蛋白酶作用于同一种蛋白质，会产生不同的酶解产物，表2列出了五种蛋白酶的底物特异性。

表2

五种蛋白酶的底物特异性

底物特异性

Lys，Arg－COOH疏水氨基酸－COOH

作用范围广作用范围广Tyr－，Phe－，Try－COOH

图2

燕麦多肽的SE－HPLC

图谱

酶种类

胰蛋白酶（Trypsin）碱性蛋白酶（Alcalase）风味酶（Flavorzyme）复合蛋白（Protamex）中性蛋白酶（Neutrase）

由表2可以看出，三种蛋白酶对底物的要求具其中碱性蛋白酶只作用于羧基末端为有特异性，

疏水氨基酸的肽键，因此由碱性蛋白酶水解制备必须进行脱苦。而的燕麦多肽具有明显的苦味，

对底物没有风味酶和复合蛋白酶的作用范围广，

特异性要求，研究表明可采用这两种蛋白酶进行多肽的脱苦。不同来源的蛋白质和水解后蛋白质的结构特征对苦味的影响很大，研究发现平均疏蛋白质或多肽才会水性大于5．85kj/mol残基时，

且产生苦味。由于复合蛋白酶比风味酶价格高，风味酶水解产生的多肽具有特殊的鲜味，因此以研究了风味酶对燕麦多肽脱平均疏水性为指标，苦的影响。

表3数据显示，当未用风味酶水解时，燕麦多肽说明其具有明的平均疏水性为105．43kj/mol残基，

在15～30min内，燕麦多肽的平均疏水显的苦味，

性急剧下降，作用30min后的平均疏水性只有20．18kj/mol残基，到90min时，燕麦多肽的平均疏水性为5．06kj/mol残基，小于产生苦味的5．85kj/mol残基，作用120min时的平均疏水性跟90min差别不大，因此采用风味酶水解90min进行燕麦多肽的脱苦。

2．4

图3

燕麦多肽的溶解性

燕麦多肽相对分子质量分布的测定

采用TskgelG2000SW×L凝胶柱对燕麦多肽

相对分子质量进行分析，以乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0．1V/V）为洗脱液，以细胞色素C（Mw12500）、抑肽酶（Mw6500）、杆菌酶（Mw1450）、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（Mw451）和乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（Mw189）为相对分子质量标准品。回归方程是lgMw=7．24－0．242T，相关系数R=0．9950，表明各相对分子质量对数与各标样的洗脱可以准确地测定燕麦多肽的相时间成很好的相关性，

对分子质量分布范围。图2是燕麦夺肽的体积排阻高效液相色谱图。从图2可以看出，燕麦多肽的相对主要集中分子质量分布范围在142～21281Da之间，在142～1413Da之间，其具体的分布情况见表4。

（下转第21页）

粮油食品科技第20卷2012年第1期

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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪（上接第18页）

表4

各峰值的保留时间

/min12．033～15．65015．650～16．90016．900～18．06718．067～19．51719．517～21．017

燕麦多肽的相对分子质量分布相对分子质量分布范围

/Da

21281～28362836～14131413～738738～329329～142

峰面积所占比例

/%

5．426．9612．3927．8034．21

燕麦蛋白在不同的pH值时其溶解度是不同的，在pH5时，溶解度最低，为1．6%，当pH大于5时，溶

99．2%解度随着pH值的增加而升高，当pH10时，的燕麦蛋白都已溶解。从图3中还可以看出，燕麦多

肽在不同的pH值范围，其溶解度没有变化，为90．6%左右，说明pH值影响燕麦蛋白的溶解性，而燕麦多肽的溶解性受pH值变化的影响较小。参考文献：

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从表4可以看出，相对分子质量在142～329Da

之间的肽含量最高，为34．21%；其次是相对分子质量在329～738Da和738～1413Da之间的肽，含量分别为27．80%和12．39%；相对分子质量在1413～2836Da和2836～21281Da之间的肽最少，含量分别为6．96%和5．42%。

2．5燕麦多肽溶解度的测定

对燕麦蛋白和燕麦多肽在pH2～10范围内的溶

结果见图3。从图3中可以看出，解度进行了测定，

227－235．●